재조합 AAV (rAAV) vector는 rep, cap gene을 제거하고 2개의 ITR 사이에 GOI 발현카세트를 삽입하는 구조로 이루어집니다. rep/cap 유전자와 helper virus 유래 성분들은 별도의 plasmid로 제공됩니다. 이렇게 함으로써 최대 4.5kb의 GOI를 single strand rAAV에 삽입할 수 있습니다. Self-complimentary rAAV vector (scAAVs)의 경우, GOI 사이즈는 2.5Kb로 제한됩니다.
여러가지 자연적으로 발생하는 AAV capsid serotype이 가능하며, 모두 다양한 조직 및 세포 특이성을 가집니다. 예를 들어 AAV6는 심장조직에 효율적으로 작용합니다.
자연적으로 발생하는 serotype외에도 유전자 치료 분야에서 계속해서 인공적으로 조작된 변이체가 등장하고 있으며 Sirion에서는 표준 혈청형과 새로운 capsid variant 모두 제공합니다.
표1은 Sirion의 경험을 기반으로 한 AAV 혈청형 특이성을 정리한 테이블로, 조직별 적합한 혈청형 선택을 위한 가이드라인입니다. (초록색은 Sirion사에 의해 입증된 serotype 입니다.)
| TARGET TISSUE | AAV Serotype |
| Skeletal muscle | AAV1***, AAV6**, AAV7*, AAV8***, AAV9*** |
| Heart | AAV1***, AAV3*, AAV4*, AAV6**, AAV8*, AAV9** |
| Lung | AAV1*, AAV4**, AAV5**, AAV6**, AAV9*** |
| Liver | AAV1*, AAV3***, AAV4*, AAV5**, AAV6*, AAV8** |
| T Cells | AAV6* |
| CNS | AAV1*, AAV2**, AAV5**, AAV6*, AAV7*, AAV8**, AAV9** |
| Hematopoietic stem cells | AAV2*, AAV3*, AAV6* |
| Embryonic stem cells, iPSC | AAV6* |
| Kidney | AAV2*, AAV4**, AAV5* |
| Pancreas | AAV1, AAV6* |
Color Key: * mice / * large animals: dogs, pigs, sheep, rabbits, cats / * human (tissue or clinical trial) / AAV serotypes specificity verified by SIRION
신경조직에 특이적인 혈청형은 다음과 같습니다.
| CELL TYPE | AAV Serotype |
| Striatal neurons | AAV1/2 |
| Hypothalamus | AAV1/2, AAV5 |
| RPE/Ganglion cells | AAV2, AAV4, AAV5 |
| Photoreceptors, Astrocytes | AAV5 |
| Motoneurons | AAV6 |
Promoter 선택
어떤 프로모터를 이용하느냐에 따라 세포 유형별 도입 유전자 발현을 더욱 강력하게 하는 도구가 될 수 있습니다. 예를 들어, rAAV5는 망막의 간상세포 (rod cell)와 원추세포 (cone cell) 모두에 transduction되지만 세포 유형 특이적인 promotor를 사용하면 두 세포 유형 모두에서 표적 발현이 가능합니다.
Sirion은 in vivo 실험을 통해 검증된 조직 특이적 promoter 패널을 제공합니다.
Recombinant AAV 제작 과정
Sirion은 맞춤형 모듈식 접근 방식을 통해 가장 비용 효율적인 업스트림(USP) 및 다운스트림(DSP) 프로세스를 결정하여 고객께서 지정한 품질요청 사항을 충족해드립니다.
Sirion은 최대 50L의 전임상 배치 생산이 가능하며, 다운스트림 공정의 경우 1-step (iodixanol gradient) 또는 2-step (affinity capture) 정제를 제공합니다. 1-step 정제로도 우수한 결과를 제공하지만, 후기 임상 적용 단계에서는 2-step 정제를 권장합니다.
Recombinant AAV QC
QC 내용에 따라 Basic, Standard, Standard analytic 패키지로 제공됩니다.
일반적인 세포 수준에서의 transduction의 경우 1-step 정제를 추천하며, 소동물이나 대동물의 타겟 장기로의 systemic delivery를 계획하는 실험, 혹은 tissue로 direct injection을 하는 경우 (예, eye, brain..)라면 2-step 정제를 추천합니다.
| QC PACKAGE |
DESCRIPTION |
| BASIC |
Genome
titration |
| STANDARD |
Genome
titration, Purity check on silver gel, Integrity check, Endotoxin test |
| STANDARD analytic |
Capsid
titer, Purity check on Silver gel, Endotoxin test |
이외에도 다양한 QC 실험을 신청하실 수 있습니다.
Sirion의 정제된 empty AAV capsid는 CGT 개발시 여러 단계에서 표준물질로서 매우 중요한 역할을 하며, 정확한 정량 분석과 검출 한계 결정이 보장되므로 결과의 신뢰도를 높여줍니다.
특히 특정 AAV 혈청형의 잠재적인 면역원성에 의한 부정적인 부작용 및 혈청 유병률 테스트를 위해 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 솔루션 입니다.
- 100% empty capsids with SIRION's innovative in-house production platform
- De novo manufacture of up to 5E15VP (virus particles)
- Cost-efficient and well characterized test and control material
- Standard Scale - 100μl @ 1.0E13 VP (virus particles)/ml
- Large Scale - 1 ml @ 1.0E13 VP (virus particles)/ml
- AAV empty particles of the requested serotype
- 1-step purification
- Premium-analytic QC in vivo buffer (PBS+0,014% Tween 20)