Chromatin NGS | CUTANA™ ChIC/CUT&RUN Kit | 고마바이오텍

CUTANA CUT&RUN Kit는? 

• ChIP-Seq은 타겟단백질이 결합된 크로마틴 부위를 침전시켜 농축하고 그 시퀀스를 NGS로 분석하는 기술입니다. 그러나 ChIP-Seq은 세포의 양이 적은 샘플의 경우 DNA를 얻기 힘들고, 노이즈 백그라운드가 높다는 한계를 갖고 있습니다. 이에 반해 CUT&RUN 시퀀싱은 온전한 세포로부터 타겟 단백질만을 잘라내는 방식으로, ChIP-Seq에 비해 적은 수의 cell 로도 분석이 가능하고, 시간이 단축되며, signal to noise ratio가 월등히 향상되어 Chromatin NGS에 효과적으로 이용될 수 있는 툴 입니다. 
• 다양한 DNA-Interacting protein 타겟에 적용할 수 있습니다. (histone PTMs, chromatin-interacting proteins including transcription factors, epigenetic enzymes, epigenetic reader proteins, chromatin remodeling proteins)

특징  

• CUT&RUN (Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease)에 의한 genomic mapping은 Histone 변형 및 Protein-DNA 상호 작용을 분석하고, 결합부위의 유전자를 규명하기 위해 이용됩니다.
• Intact cell이나 핵내에 타겟에 대한 항체를 반응 시킨 후, Proteins A and/or G to Micrococcal Nuclease (pAG-MNase)가 in situ에서 항체가 결합된 chromatin만 선택적으로 자르는 특성을 이용하여 타겟만을 특이적으로 절단하므로 백그라운드가 감소됩니다.
  
• ChIP-seq 실험에 비해 훨씬 적은 시간과 비용으로 고해상도로 히스톤 PTM 및 염색질 상호 작용 단백질을 매핑합니다. (데이터까지 4일 소요)
• 적은양의 샘플(5,000개-500,000개 세포), 적은양의 sequencing reads로도 고품질의 시퀀싱 데이터를 얻을 수 있습니다.
• 세포, 핵, 동결세포, 조직, 면역세포, crosslinked material등 다양한 시료에 따른 최적의 상세한 샘플 준비 프로토콜을 제공합니다. 
• 4가지의 CUTANA H3K4 MetStat Spike-in Controls을 제공하여 실험 결과 및 troubleshooting시 실험의 정확도를 입증합니다. 
  

프로토콜

1. lectin-coated 된 magnetic bead (concanavalin A (ConA) beads)에 cell을 고정하고 permeabilization화 합니다.

2. 크로마틴 타겟(ex: 히스톤 PTM 또는 크로마틴/DNA 결합 단백질)에 대한 항체를 반응시킵니다.

3. CUTANA pAG-MNase를 처리하여 타겟 nucleosome을 잘라냅니다.

4. CaCl2+를 넣으면 nucleosome complex가 유리됩니다.

5. nucleosome complex로부터 DNA를 추출 및 정제하여 sequencing library를 준비합니다.

6. NGS를 진행합니다.

실험과정

Day 1) CUTANA™ CUT&RUN Kit을 이용하여 nucleosome complex를 얻습니다.

Day 2) DNA를 추출하고 NGS를 위한 library를 준비합니다. 

Day 3) NGS 시퀀싱을 진행합니다. 

Day 4) 데이터를 분석합니다.

• ConA Beads (21-1401)
  
• SA Beads (21-1402)
• Bead Activation Buffer (21-1001)
• Pre-Wash Buffer (21-1002)
• Stop Buffer (21-1003)
• 5% Digitonin (21-1004) 
  
• 1 M Spermidine (21-1005)
• pAG-MNase (15-1016) 
• H3K4me3 Positive Control Antibody (13-0041k)
• Rabbit IgG Negative Control Antibody (13-0042k)
• E. coli Spike-in DNA (18-1401)
• CUTANA H3K4 MetStat Spike-in Controls (19-1006,19-1321,19-1334,19-1316)
• 8-strip Tubes (10-0009k)
  
• DNA Cleanup Columns (10-0010)
• DNA Collection Tubes (10-0011) 
• 0.5 M EDTA (21-1006)
• 100 mM Calcium Chloride (21-1007)
• DNA Binding Buffer (21-1008)
• DNA Wash Buffer (21-1009)
• DNA Elution Buffer (21-1010)

A representative 350 kb region of an H3K4me1 profile in K-562 cells, generated using CUT&RUN (yellow panels), native ChIP-seq (blue panels), or crosslinked ChIP-seq (green panels). All  data were generated by EpiCypher and are expressed as reads per million (RPM). Color-coded gradient (to left) represents S/N ratios determined by genome wide analysis (bamFingerprint data, not shown).

ChIP-seq vs. CUT&RUN vs. CUT&Tag 비교