NGS 시퀀싱을 위한 CUTANA™ CUT&RUN Library Prep Kit | 고마바이오텍

특징 

• CUTANA™ CUT&RUN Library Prep Kit는 CUT&RUN assay를 통해 얻은 DNA로부터 Illumina NGS 시퀀싱을 하기 위해 DNA library 준비에 필요한 모든 제품을 제공합니다. (enzymes, indexing primers, DNA purification beads, buffers, PCR tubes)
• CUT&RUN을 이용한 크로마틴 매핑시, CUT&RUN kit (#14-1048)와 함께 사용함으로써 cell 부터 시퀀싱까지 손쉽게 진행할 수 있습니다.  
• 0.5 ng 정도의 낮은 input으로도 고품질의 데이터를 제공합니다.
  

​구성품

• 8-strip tubes (10-0009k)
  
• SPRIselect reagent (21-1403)
• 0.1X TE Buffer (21-1011)
• End Prep Enzyme (15-1019)
• End Prep Buffer (21-1012)
• Adapter for Illumina (18-1000)
• Ligation Mix (15-1020)
• Ligation Enhancer (15-1021)
• U-Excision Enzyme (15-1023)
• High Fidelity 2X PCR  Master Mix (For sample indexing PCR) (15-1022)
• i5 and i7 Primers (14-1001 contains i7 primers 1-6 and 14-1002 contains i7 primers 7-12. Both kits contain i5 primers 1-8.)  (Primer  자세히 보기)

실험 과정

 

프로토콜

CUT&RUN 농축 DNA를 복구하고 Illumina® Adapter에 연결한 후 U-절단을 통해 PCR 증폭이 가능합니다. 샘플은 i5 및 i7 인덱싱 프라이머의 다양한 조합을 사용하여 PCR 중에 이중 바코드로 표시됩니다. 최종 라이브러리는 모세관 전기영동(예: Bioanalyzer) 및 Qubit로 분석되고, 모아지고, 시퀀싱을 위해 원하는 Illumina® 장비에 로드됩니다.

참고 데이터 

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1. 0.5ng 의 적은 인풋으로도 고품질의 시퀀싱 라이브러리 제작

Intergrative 500k K562 세포를 이용하여 H3K27me3 항체의 CUT&RUN을 수행한 137kb window를 Genomics Viewer(IGV, Broad Institute)을 이용하여 Gene browser를 촬영하였습니다. 라이브러리 준비 프로토콜에서 CUT&RUN DNA 인풋을 줄여 낮은 타겟 풍부도나 낮은 세포 인풋 실험을 시뮬레이션 했습니다. 데이터는 인풋에 따른 차이를 보이지 않고, Illumina NGS-ready 라이브러리 준비를 풍부하게 보였습니다. 

2. CUT&RUN DNA 조각 크기 분포 분석 ​

500k K572세포로부터 CUTANA ChIC/CUT&RUN Kit(EpiCypher 14-1048)을 이용하여 CUT&RUN을 수행하였습니다. IgG(EpiCypher 13-0042), H3K4me3(EpiCypher 13-0041), H3K27me3(ABclonal A16199), CTCF(EpiCypher 13-2014) 항체를 이용한 반응에서 얻은 5 ng의 CUT&RUN output DNA로 CUTANA CUT&RUN Library Prep Kit로 paired-end Illumina sequencing을 위해 라이브러리를 준비했습니다. Agilent TapeStation®로 라이브러리 DNA를 분석하였습니다.  

3. Representative gene browser tracks 

NextSeq 2000 with a P3 cartridge (paired-end 2x50 cycle). Data were aligned to the hg19 genome using Bowtie2. Data were filtered to remove duplicates, multi-aligned reads, and blacklist regions. A representative 640 kb window at the SEPTIN5 gene is shown for three replicates ("Rep") of IgG and H3K4me3 antibodies, as well as individual tracks for H3K27me3 and the transcription factor CTCF, demonstrating the robustness and reproducibility of the workflow with a variety of targets. Sequencing libraries prepared with the CUTANA CUT&RUN Library Prep kit produced the expected genomic distribution for each target. Sample sequencing depth was as follows (millions of reads): IgG Rep 1 (20.1), IgG Rep 2 (16.6), IgG Rep 3 (16.1), H3K4me3 Rep 1 (7.3), H3K4me3 Rep 2 (17.2), H3K4me3 Rep 3 (13.8), H3K27me3 (13.4), CTCF (16.2). Images were generated using the Integrative Genomics Viewer (IGV, Broad Institute). 

4. Quality control analysis of the CUTANA™ CUT&RUN Library Prep Kit workflow

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