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CUTANA™ CUT&Tag Kit는?
Cleavage Under Targets & Tagmentation (CUT&Tag) 은 CUT&RUN과 ChIC 기술을 기반으로 하는 epigenomic mapping 기술입니다. CUTANA™ CUT&Tag에서는 핵을 고체 지지대에 고정하고 항체를 in situ로 chromatin target에 결합합니다. pAG-Tn5(단백질 A, 단백질 G와 prokaryotic transposase 5의 fusion)를 이용하여 선택적으로 절단하고 항체가 결합된 크로마틴을 시퀀싱 어댑터로 tagment합니다. Tagment된 조각은 EpiCypher의 "Direct-to-PCR"을 통해 단일 튜브에서 바로 증폭됩니다.
기존의 ChIP-seq에 비해, CUT&Tag은 민감도가 향상된 고품질의 시퀀싱 데이터를 제공합니다. Chromatin-fragmentation이나 IP 없이, 온전한 핵에서 항체가 라벨링된 크로마틴을 선별적으로 타겟팅하여 ChIP-seq에 비해 백그라운드가 확연히 줄어듭니다.
특징
- 반응당 10만 개의 핵(Nuclei)을 권장하며, 최소 1만 개까지 가능합니다. 생세포, 냉동 샘플, 약하게 고정된(cross-linked) 샘플 모두 사용 가능합니다.
- 세포에서 시퀀싱 라이브러리 제작까지 필요한 모든 시약(시퀀싱 프라이머 포함)이 들어 있습니다.
- 8-strip 튜브를 사용하고, 독자적인 'Direct-to-PCR' 프로토콜을 통해 샘플 손실을 최소화하고 처리량을 높였습니다.
- Control 항체와 뉴클레오솜 spike-in을 통해 실험 최적화 및 상시 모니터링이 가능합니다.
- 로트(lot)마다 엄격한 QC를 거쳐 일관된 결과를 보장합니다.
- 항체에 결합된 염색질을 pAG-Tn5 융합 단백질이 선택적으로 절단함과 동시에 시퀀싱 어댑터를 붙이므로 (tagmentation), 별도의 라이브러리 과정이 필요 없습니다.
- 히스톤 PTM(변형) 분석에 최적화되어 있습니다. (전사 인자 같은 단백질은 CUT&RUN 제품을 권장합니다.)
버전 4에서 개선된 사항
- 버퍼 강화제 (Wash Buffer Enhancer)와 DNA 정제 비드가 추가되었습니다.
- 버퍼 강화제는 비드 뭉침 현상을 줄여 핸들링을 개선하고, 정제 비드는 정확한 사이즈 선택과 높은 수율을 보장합니다.
- 핵 재부유(Resuspension) 과정을 개선하여 샘플 보존력을 높였으며, 다채널 피펫 사용이 가능하도록 설계되어 재현성을 높였습니다.
제품 종류
| Cat.
No. |
Product |
| 14-1102-48s1 |
CUTANA™ CUT&Tag
Kit - 48 Reactions (Primer Set 1) |
| 14-1102-48s2 |
CUTANA™ CUT&Tag
Kit - 48 Reactions (Primer Set 2) |
| 14-1102-24s3 |
CUTANA™ CUT&Tag
Kit - 24 Reactions (Primer Set 1 Subset) |
Kit 구성품
| Component |
Cat. No. |
| CUTANA™
pAG-Tn5 for CUT&Tag |
15-1017t |
| H3K27me3
Antibody, SNAP-Certified™ for CUT&RUN and CUT&Tag |
13-0055t |
| H3K4me3
Positive Control Antibody |
13-0060t |
| CUTANA™
Rabbit IgG CUT&RUN Negative Control Antibody |
13-0042t |
| Anti-Rabbit
Secondary Antibody for CUTANA™ CUT&Tag Workflows |
13-0047t |
| SNAP-CUTANA™
K-MetStat Panel |
19-1002t |
| CUTANA™
Concanavalin A Conjugated Paramagnetic Beads |
21-1401t |
| CUTANA™
Non-Hot Start 2X PCR Master Mix for CUT&Tag |
15-1018t |
| CUTANA™
CUT&RUN 8-strip 0.2 mL Tubes |
10-0009t |
| 4.5 M NaCl |
21-1013t |
| 0.5 M EDTA |
21-1006t |
| 1 M MgCl2 |
21-1015t |
| SDS Release
Buffer |
21-1017t |
| SDS Quench
Buffer |
21-1018t |
| 0.1X TE
Buffer |
21-1025t |
| Pre-Wash
Buffer |
21-1002t |
| Pre-Nuclear
Extraction Buffer |
21-1021t |
| Bead
Activation Buffer |
21-1001t |
| 5% Digitonin |
21-1004t |
| 1 M
Spermidine |
21-1005t |
| Wash Buffer
Enhancer 1 |
21-1028t |
| Wash Buffer
Enhancer 2 |
15-1030t |
| CUTANA™ DNA
Purification Beads |
21-1407t |
| Multiplexing
Primers |
14-1102-48s1 : Primer Set 1 포함
14-1102-48s2 : Primer Set 2 포함
14-1102-24s3 : Primer Set 1 Subset 포함 |
- 14-1102-48s1과 14-1102-48s2는 각각 최대 48개의 반응(샘플)을 동시에 시퀀싱할 수 있는 조합형 이중 인덱스(combinatorial dual indices)를 포함하고 있습니다. 두 키트를 함께 사용하면 최대 96개의 샘플을 한꺼번에 분석(멀티플렉싱)할 수 있습니다.
- 14-1102-24s3은 프라이머 세트 1(48s1)의 일부 구성을 포함하고 있으며, 최대 24개의 샘플을 동시에 시퀀싱할 수 있는 조합형 이중 인덱스를 포함합니다. 이 키트를 14-1102-48s2와 결합하여 사용하면 최대 72개의 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다.
함께 이용하는 제품 (별도 준비)
프로토콜
1. Magnetic ConA beads에 Nuclei 를 고정시킵니다.
2. 타겟 PTM에 대한 1차 & 2차 항체를 반응시킵니다.
3. pA-Tn5 (transpose)와 Mg2+를 처리하여 항체가 붙은 타겟 크로마틴을 절단하고 시퀀싱 어댑터를 tagging 합니다.
4. PCR로 DNA를 증폭합니다.
5. NGS로 시퀀싱을 진행합니다.
실험과정
Day 1-2) CUTANA™ CUT&Tag Kit을 이용하여 NGS를 위한 library를 준비합니다.
Day 2-3) NGS 시퀀싱을 진행합니다.
Day 3) 데이터를 분석합니다.
실험 데이터
▒ CUT&Tag DNA fragment size distribution analysis
CUT&Tag을 수행한 결과 데이터입니다. Library DNA는 Agilent TapeStation®으로 분석되었으며, 이를 통해 mononucleasome은 300-400bp 사이의 peak에서, dinucleasome은 500-700bp 사이의 peak에서 관찰되었습니다.
▒ SNAP-CUTANA™ K-MetStat Spike-in controls
16가지 서로 다른 K-메틸 PTM 상태 (mono-, di-, tri-methylation at H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H4K20, unmodified control)의 dNucs을 CUT&Tag 샘플에 스파이크하였고, spike-in control로 이용되는 SNAP-CUTANA K-MetStat Panel (#19-1002)로 최적의 실험조건을 확인하였습니다.
16가지의 서로 다른 리신 메틸화(K-methyl) PTM 상태(H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H4K20의 각 mono-, di-, tri-methylation 및 수정되지 않은 대조군)를 나타내는 DNA-바코드 디자인 뉴클레오솜(dNucs)을 키트에서 제공하는 대조군 항체(IgG, H3K27me3)를 넣기 전 CUT&Tag 샘플에 혼합(spiked)했습니다.
시퀀싱 후, CUT&Tag 반응에서 회수된 각 스파이크-인 바코드의 빈도를 계산하였으며, 스파이크-인 제품 페이지(EpiCypher 19-1002)에서 제공하는 쉘 스크립트와 분석 엑셀 시트를 사용하여 raw fastq 파일로부터 정규화(normalization)를 진행했습니다.
본 키트에 포함된 IgG(상단; 전체 리드 수의 합으로 정규화)와 H3K27me3(하단; 온-타겟 리드로 정규화) 항체의 바코드 결과가 표시되어 있습니다. 이 스파이크-인 데이터를 통해 최적의 실험 조건임을 확인했습니다. (H3K27me3 항체는 타겟 dNuc을 특이적으로 회수하였고, IgG는 어떠한 우선적 농축도 보이지 않았습니다.)
▒ CUT&Tag genome-wide heatmaps
CUT&Tag 수행 결과를 히트맵으로 표시한 결과입니다.
CUT&Tag 실험은 위에서 기술된 방식대로 수행되었습니다. 히트맵(Heatmaps)은 IgG, H3K27me3, H3K4me1, 그리고 H3K4me3 항체에 대한 두 번의 반복 실험("Rep") 결과를 보여주며, 각 행은 H3K4me3 Rep 1 반응의 강도(Intensity)를 기준으로 정렬(Ranked)되었습니다.
강도는 높음(빨간색), 중간(노란색), 낮음(파란색)으로 표시되었습니다. 히스톤 PTM 항체들은 예상되었던 농축 패턴과 높은 재현성을 나타냈습니다. 활성 전사 마커이자 전사 시작 부위(TSS)에 위치하는 H3K4me3는 억제성 염색질 마커인 H3K27me3와 반대되는 농축 양상을 보였으며, H3K4me1 신호는 TSS의 양옆(flanks)에서 나타났습니다. 대조군인 IgG는 낮은 배경 농축(background enrichment, 노이즈)을 보여주었습니다.
ChIP-seq vs. CUT&RUN vs. CUT&Tag 비교
*CUT&Tag has been applied for single-cell chromatin analysis in the literature. However, the recommended input for CUTANA™ CUT&Tag assays is 10,000 to 100,000 cells.
주요 사용 논문
Kaya-Okur et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat. Comm. 10, 1930 (2019). (PMID: 31036827)
This paper introduces CUT&Tag methodology, as developed by the Henikoff laboratory at the Fred Hutchinson Cancer Research Center. It describes how the Tn5 fusion proteins works, demonstrates the application of CUT&Tag for histone PTM and chromatin factor profiling, and reveals major advantages of this new technology. Specifically, they use CUT&Tag to generate high-quality histone PTM profiles from single cells, a major advancement for the epigenetics field.
Kaya-Okur et al. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat. Protoc. 15, 3264-3283 (2020). (PMID: 32913232)
Here, the inventors of CUT&Tag provide a highly detailed description of their optimized CUT&Tag protocol, citing EpiCypher’s pAG-Tn5 as the suggested commercial vendor of the enzyme. The protocol highlights critical steps, includes a troubleshooting FAQ table, and shows example results.
Henikoff et al. Efficient transcription-coupled chromatin accessibility mapping in situ. by nucleosome-tethered tagmentation. Elife 16;9:e63274.(2020). (PMID: 33191916)
The inventors of CUT&RUN / CUT&Tag technology leveraged EpiCypher’s pAG-Tn5 and CUT&RUN compatible histone PTM antibodies to develop a modified version of CUT&Tag for chromatin accessibility mapping. Importantly, this new method generates robust, high-quality profiles using only 3-5M reads/samples (vs. 20-30M reads for standard ATAC-seq).
Janssens et al. Automated CUT&Tag profiling of chromatin heterogeneity in mixed-lineage leukemia. Nat. Genet. 53, 1586-1596 (2021). (PMID: 34663924)
Assay automation is a major feature of CUT&Tag, as this will enable higher throughput for clinical research projects. In this study, Janssens et al. develop an automated CUT&Tag platform and use it to map oncofusion proteins, transcription factors, and histone PTMs in samples from leukemia patients. They also modified their approach for single cell analysis to assess inter- and intra-tumor heterogeneity.
Janssens et al. CUT&Tag2for1: a modified method for simultaneous profiling of the accessible and silenced regulome in single cells Genome Biol. 23, 81.(2022). (PMID: 35300717)
CUT&Tag2For1 is an innovative application of CUT&Tag profiling technology that allows simultaneous, high-resolution mapping of transcription initiation (RNA Pol II phospho S5) and repressive domains (H3K27me3) in single cells or bulk populations. Mapping multiple chromatin features in a single reaction is important when cell numbers are limiting, including biopsy studies and clinical research.
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CUT&RUN vs. CUT&Tag 비교
