특징
- ioGABAergic Neuron은 opti-ox 기술을 이용하여 iPSC에서 재프로그래밍된 GABA성 뉴런입니다.
- Revival 후 4일 이내에 GAD1, GAD2, VGAT, DLX1, DLX2와 같은 GABAergic neuron의 특이 마커를 발현합니다.
- 칼슘 이미징을 이용하여 ioGABAergic Neuron이 spontaneous activity를 보이는 것을 확인하였습니다.
- 신경 회로, 신경 발생, 퇴행성 신경 질환 및 신약 개발 등의 연구에 human model로 사용하기에 적합합니다.
- ioGlutamatergic Neuron 및 astrocyte와 함께 이중, 삼중 배양을 함으로써 복잡한 세포 간 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
사양
| Starting
material |
Human iPSC line |
| Donor |
Caucasian adult male (skin
fibroblast) |
| Format |
Cryopreserved cells |
| Differentiation
method |
opti-ox™ cellular reprogramming |
| Karyotype |
Normal (46, XY) |
| Vial size |
Small: 3 x 10^6 viable cells |
| Recommended
seeding density |
150,000 cells/cm2 |
| Seeding
compatibility |
6, 12, 24, 96 & 384 well plates |
| Quality
control |
Sterility, protein expression (ICC),
gene expression (RT-qPCR) |
프로토콜
ioGABAergic Neuron 냉동 보존 형식으로 제공되며 권장 배지에서 재생 시 빠르게 성숙되도록 프로그래밍되어 있습니다.
Phase 0 단계의 세포를 수령 후, Phase 1, 2 과정을 거쳐 실험에 바로 이용합니다.
1) Phase 0 : Induction (bit.bio에서 Induction 후 제공)
2) Phase 1 : 고객이 세포를 수령 후 plating 하여 안정화시키는 기간 (3일)
3) Phase 2 : 세포가 성숙하는 기간
참고 데이터
1. opti-ox precision reprogrammed ioGABAergic Neurons rapidly form a homogenous neuronal population
냉동보존된 ioGABAergic Neuron의 해동 후, 신속하고 균질하게 신경세포로 성장하는 과정을 저속 촬영한 12일간의 타임랩스 비디오입니다.
2. ioGABAergic Neurons express GABAergic neuron-specific markers
revival 후 10일째의 면역형광 염색은 ioGABAergic 뉴런이 GABA(노란색), pan-neuronal marker인 MAP2(빨간색) 및 DAPI 대조염색(파란색)에 대해 양성임을 보여줍니다.
3. ioGABAergic Neurons show mature neuronal networks by day 12
재프로그래밍 시 ioGABAergic 뉴런은 급속한 형태학적 변화를 보이며, 뉴런은 revival 후 7일째에 확인됩니다. Mature neuronal network은 12일까지 관찰됩니다. 이미지는 해동 후 1-12일을 보여줍니다.(10X magnification; scale bar: 200 μm)
4. Single-cell RNA sequencing shows ioGABAergic Neurons form a pure population (>95%) of mature GABAergic neurons
ioGABAergic Neuron의 단일 세포 RNA 서열 분석을 세가지 특정 시점(0일, 7일 및 14일)에 수행하였습니다. 7일째까지, 집단은 성숙한 유사분열 후 GABA성 뉴런의 순수 집단(>95%)을 나타내는 뚜렷한 발현 프로필을 갖습니다. 유전자 발현은 10x Genomics scRNA 시퀀싱으로 평가되었습니다.
5. Single cell RNA sequencing shows mature ioGABAergic Neurons express key GABAergic markers
ioGABAergic Neuron의 단일 세포 RNA 서열 분석을 세가지 특정 시점(0일, 7일 및 14일)에 수행하였습니다. 7일째에는 주요 GABA성 마커 유전자(GAD1, GAD2, SLC32A1(VGAT), DLX2, DLX5)의 발현이 pan-neuronal marker인 MAP2와 함께 유사분열 후 GABA성 뉴런에서 검출될 수 있었습니다. 유전자 발현은 10x Genomics scRNA 시퀀싱으로 평가되었습니다.
6. Calcium imaging of ioGABAergic Neurons demonstrates spontaneous activity
revival 후 16일째에 칼슘 이미징을 실시한 ioGABAergic 뉴런의 자발적인 활동을 보여주는 비디오입니다.
Opti-ox 기술이란?
- Opti-ox는 Optimized inducible overexpression Tet system을 이용하여 특정 transcriptional factor 발현을 유도하는 시스템입니다.
- Opti-ox는 Dual targeting cassette로 구성되어 있습니다.
- cassette(1)은 Dox (doxycyclin)에 의해 조절되는 transcriptional activator protein 유전자를 삽입하고
- cassette(2)는 (1)에 의해 조절되는 transcription factor를 삽입합니다.
- 즉, Dox양에 의해 transcriptional activator protein 발현이 유도되고, 이에 의해 특정 transcription factor의 발현이 조절되어 원하는 cell 타입으로 리프로그래밍을 유도할 수 있습니다.
1) Lot to Lot variation이 없습니다.
2) Scale up production이 가능합니다.
3) 세포 안정화 후 바로 실험이 가능하므로 실험시간을 단축시킬 수 있습니다.