1. CUTANA CUT&RUN Library Prep Kit을 사용하기 위해 권장하는 input의 양은 얼마인가요?
Kit를 사용하기 위해 권장하는 인풋의 양은 CUT&RUN enriched DNA 0.5-10ng 입니다.
인풋 범위는 read duplication의 비율을 확인을 통한 라이브러리 복잡도, 어댑터 이량체 생성, NGS 데이터의 품질(signal-to-noise ratio, peak structure의 기대 관측치)을 기준으로 검증하였습니다.
2. Library prep의 반응마다 동일한 양의 인풋을 사용하는 것이 중요한가요?
ChIP-seq의 경우에는 인풋의 정규화가 중요합니다. 하지만, CUT&RUN library prep에 사용된 DNA의 양은 고품질의 NGS 데이터를 얻는 데에 꼭 필요하며, 인풋을 동일한 양으로 정규화하는 것보다 DNA의 절대적인 양이 중요합니다.
3. Adapter dimers는 무엇이며, library prep에서 무엇이 adapter dimers의 생성에 영향을 주나요?
어댑터 이량체는 어댑터를 시퀀싱하는 중 self-ligation에 의해 생성되고, ~125bp 정도로 매우 작기 때문에 먼저 증폭됩니다.
인풋 DNA가 적으면, 어댑터의 자기 상호 작용과 이량체 생성이 증가합니다. 어댑터 ligation의 비효율적인 균질화는 어댑터 이량체의 생성을 촉진합니다. 과잉의 SPRIselect 시약은 라이브러리 준비 동안 짧은 어댑터 이량체 절편의 지연을 증가하게 합니다.
만약, CUT&RUN 라이브러리에 어댑터 이량체가 너무 많으면, gel purification을 통해 제거할 수 있습니다.
4. Library prep을 할 때, 0.5ng보다 적은 양의 CUT&RUN enriched DNA를 사용해도 괜찮을까요?
0.5 ng 보다 적은 DNA를 사용하여도 괜찮은 데이터를 얻을 수 있지만, 수율이 급격히 감소하고, 어댑터 이합체가 생성되거나 read diversity가 감소하여 좋은 결과를 얻지 못할 수 있습니다. 이를 해결하기 위해, gel purification을 이용하여 어댑터 이합체를 제거하고, rate이 20%가 넘을 때는 중복된 reads를 필터하고 시퀀싱 뎁스를 올려, DNA의 양이 적어 발생한 문제를 해결할 수 있습니다.
5. CUT&RUN DNA가 library prep을 위해 준비되었다고 어떻게 확인할 수 있을까요? 조각의 크기나 CUT&RUN DNA의 target enrichment를 확인할 수 있을까요?
ChIP에서는 조각 크기 분포를 확인합니다. 하지만, CUT&RUN은 종종 매우 적은 양의 DNA로 진행하여, 조각의 크기로 필터를 하고 나면 그 양이 감도보다 적기 때문에 라이브러리 준비 전에 전기영동 분석을 별도로 하지 않습니다.
6. Library prep을 하기 전, CUT&RUN DNA의 크기를 선택하거나 조각을 내야할까요?
DNA를 조각 내거나 사이즈를 선별하는 것은 필요하지도 않고, 권장되지도 않습니다.
CUT&RUN은 주로 단일 뉴클레오솜 사이즈의 DNA 조각으로 진행하며 in-situ assay이므로 ChIP에 비해 수율이 낮습니다. 추가로 조각을 내거나 사이즈를 선별하는 것은 CUT&RUN enriched target DNA이 손실될 위험이 있습니다.
7. 이 키트의 library 수율은 어느 정도인가요?
라이브러리 수율은 인풋으로 사용된 CUT&RUN DNA 양과 PCR cycle 수에 따라 다릅니다. 5ng DNA 인풋을 사용하여 매뉴얼을 따라 PCR을 수행하면, 대략 300-500ng의 수율이 나옵니다. 200-700bp 범위의 라이브러리 몰농도는 보통 100-200nM입니다. EpiCypher는 1-4nM의 풀링 라이브러리를 사용하고, 필요한 농도에 맞춰 희석합니다.
8. Library 수율이 낮으면 무엇을 해야할까요?
Illumina sequencing을 위해 요구되는 수준의 라이브러리 수율을 얻지 못했다면, 더 많은 CUT&RUN enriched DNA input을 이용하여 라이브러리 준비를 반복하는 것을 권장합니다. Indexing PCR 동안의 PCR cycle수를 늘이는 방법도 있습니다. 이렇게 하면, 조각 분포 분석의 수율도 향상되고 NGS의 표준 농도에서 샘플 풀링하는 것도 가능하게 됩니다. 단, PCR cycle수를 늘이면 read 중복 비율이 증가하여, read 다양성을 얻기 위해서는 genomic region의 시퀀싱을 수차례 반복하는 deeper sequencing이 필요하게 됩니다.
9. 이 키트를 전사 인자(TFs)의 CUT&RUN library prep에도 사용할 수 있을까요?
표준 CUTANA CUT&RUN Library Prep 프로토콜은 뉴클레오솜 수준의 해상도를 만들고 전사 인자를 포함한 대부분의 타겟에 대해 고품질 데이터를 만듭니다.
10. CUT&RUN library를 시퀀싱할 때 PhiX spike-in control을 사용해야 할까요?
복잡도가 낮은 라이브러리의 다양성을 향상하고 시퀀싱 실행 품질을 모니터하기 위해 Illumina는 PhiX spike-in control을 사용하는
것을 권장합니다. EpiCypher는 saturation을
막기 위해 genomic DNA가 충분한 복잡도를 가지기 때문에 PhiX
CUT&RUN 시퀀싱의 spike-in은 포함하지 않고, NGS run을 검증하기 위해 read depth를 희생하지 않는
다른 측정법을 사용합니다.
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