1. NGS 할때 왜 rRNA를 제거해야 할까요?
전체 RNA(Total RNA) 샘플에서 리보솜 RNA(rRNA)는 무려 80~90% 이상을 차지합니다. 이를 그대로 시퀀싱(NGS)하면 데이터의 대부분이 쓸모없는 rRNA로 채워져 비용과 시간이 낭비됩니다. riboPOOLs는 이 무의미한 rRNA만 골라내어 제거(Depletion)함으로써, 우리가 진짜 분석하고 싶은 유전자(코딩 및 비코딩 RNA)의 데이터 비중을 높여주는 유전체 분석 필수 전처리 키트입니다.
2. riboPOOL은 기존의 ribosomal RNA (rRNA) depletion solution과 어떻게 다른가요?
riboPOOL은 독점 알고리즘으로 설계된 biotinylated DNA probe pool로, 다른 솔루션과 비교하여, polyA 의존성이 없고, 효소가 필요 없으며, 효율이 높고 단일/다중 species에서 rRNA 또는 기타 풍부하게 존재하고 있는 RNA를 제거하는데 사용할 수 있습니다.
- 어떤 생물종이든 가능 (Any species): 이미 개발된 70가지 이상의 생물종 맞춤형 키트를 선택할 수 있으며, 목록에 없는 생물은 주문 제작도 가능합니다.
- 효소를 쓰지 않는 방식 (Enzyme-free): RNase H 같은 효소를 사용하지 않는 프로토콜이라서, 실험 과정 중 소중한 RNA 샘플이 의도치 않게 분해될 위험을 최소화했습니다.
- 독보적인 유연성 (Multi-organism): 여러 종류의 프로브를 섞어서 사용할 수 있습니다. 예를 들어, '사람 몸속의 미생물(숙주-마이크로바이옴)'처럼 여러 생명체가 섞인 샘플도 한 번에 처리할 수 있습니다.
- 안정적인 샘플 수용 범위: 상태가 아주 좋은 RNA(RIN 10)부터 심하게 손상된 RNA(RIN 1)까지 모두 효과적으로 작동하며, 입력 가능 용량도 10 ng에서 3 µg까지 폭넓게 지원합니다.
3. riboPOOL의 주요 활용법을 RNA-seq, Ribo-seq 측면에서 각각 알려주세요.
일반적인 RNA-Seq (전체 전사체 분석) 측면
기존의 Poly(A) 방식은 꼬리가 달린 mRNA만 골라내기 때문에 꼬리가 없는 비코딩 RNA(lncRNA, circRNA)나 박테리아 RNA 등은 놓치게 됩니다. 반면 riboPOOLs는 rRNA만 쏙 빼내는 방식이므로, 분해된 RNA나 FFPE(조직) 샘플은 물론 모든 종류의 유용한 RNA(코딩+비코딩)를 온전히 보존해 유전체 커버리지를 넓혀줍니다. 일루미나(Illumina) 숏리드 시퀀싱과 옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore) 롱리드 시퀀싱 모두와 호환됩니다.
Ribo-Seq (리보솜 프로파일링) 측면
Ribo-Seq은 세포 내에서 실제로 단백질이 만들어지는 '실시간 번역(Translation) 상황'을 스냅샷 찍듯 분석하는 최첨단 기법입니다. 리보솜이 붙어 있는 약 30개 염기 크기의 아주 짧은 RNA 조각(RPF)을 분석합니다.
riboPOOLs는 전용 키트가 존재하여, Ribo-Seq 실험 시 낭비되는 rRNA 리드를 줄여줍니다. 이를 통해 실제 단백질 합성 효율, 새로운 유전자 번역 시작 부위(ORF), 전사 및 번역 속도 비교 등을 훨씬 정확하게 측정할 수 있도록 돕습니다.
4. Pan-riboPOOL과 single-species riboPOOL 중 어떤 것이 더 rRNA depletion에 효과적인가요?
riboPOOL은 single species에서 95% 이상의 rRNA depletion 효과를 가집니다. 여러 species에 대한 Pan-riboPOOL은 다양한 종에 걸쳐 다양한 적용과 효율적인 depletion 균형을 달성하도록 설계되었습니다. Pan-riboPOOL은 또한 높은 depletion 효율을 달성할 수 있지만 종마다 다를 수 있습니다.
5. RiboPOOL을 분해된 RNA와 함께 사용할 수 있나요?
RiboPOOL은 RIN 값이 ≥ 7인 DNA-free 고품질 RNA에서 가장 잘 작동합니다. RNA 분해가 증가하면 풀다운 효율이 감소할 수 있지만, RiboPOOL의 높은 복잡성은 이를 방지하는 데 도움이 됩니다.
6. 샘플에 인간 및 박테리아 rRNA가 포함되어 있습니다. RiboPOOL을 결합하여 single depletion step에서 사용할 수 있을까요?
네. riboPOOL은 사용자가 결합할 수 있고, 혹은 riboPOOL combination을 구입하여 사용할 수 있습니다. riboPOOL을 결합하려면 샘플에 존재하는 종별 RNA의 비율을 결정하고 해당 양의 riboPOOL을 사용합니다. 이를 모르는 경우 1:1 비율을 사용하고 그에 따라 최적화합니다. 최대 4개의 riboPOOL을 사용자가 지정한 비율로 combination riboPOOL에 결합할 수 있습니다. riboPOOL을 결합할 때 총 프로브 양을 100pmol/reaction으로 유지하고 혼성화 완충액의 비율이 일정하게 유지되도록 하세요. (예: 최종 부피 20μl에 5μl).
7. 샘플의 RNA 양이 100ng 미만인 경우에도 riboPOOL을 사용할 수 있나요?
input 양이 10 - 100ng 사이일 경우, 반응당 riboPOOL 양을 ~30pmol로 줄이십시오. 이렇게 하려면 권장량의 3배에 해당하는 nuclease-free water를 사용하여 kit에 있는 riboPOOL을 재현탁하고 반응당 생성된 용액 1 μl를 사용합니다.
8. 리보솜 프로파일링 샘플에 RiboPOOL을 사용할 수 있나요?
리보솜 보호 단편의 길이가 짧기 때문에(17-35nt) rRNA depletion은 일반적으로 덜 효율적입니다. 인간 riboPOOL은 이러한 샘플에서 ~70%의 depletion 효율을 갖는 것으로 보고되었지만, 성능은 샘플 조건에 따라 달라질 수 있습니다. rRNA 제거를 더욱 향상시키기 위해 rRNA depletion 후 남은 rRNA 서열에 대해 맞춤형 riboPOOL도 적용되었습니다.
9. 어떤 RNA-Seq library prep kit이 riboPOOL과 호환되나요?
riboPOOL은 대부분의 library prep kit와 호환되며 Illumina의 Stranded Total RNAseq, KAPA RNA HyperPrep 및 NEBNext library prep kit와 함께 성공적으로 사용되었습니다.