1. Topoisomerase란 무엇인가요?
Topoisomerase는 DNA의 꼬임상태를 변화시켜 핵산의 기능발휘를 위한 필수적인 효소입니다. 이러한 효소는 type 1 topoisomerase과 type 2 topoisomerase로 분류가 되는데 type 1은 supercoil을 풀어주고 type 2는 supercoil을 꼬아주는 역할을 하는 효소 입니다. Topoisomerase는 암세포에 더 큰 활성을 보임으로써 항암제 개발의 표적효소로 많이 사용 되고 있습니다.
2. Topoisomerase는 어떻게 보관해야 하나요?
Topo II는 -70 ℃이고, topo I은 -20 ℃ 입니다. 잦은 냉동/해동의 반복을 피하기 위해서는 aliquot 하여 저장 하는 것을 권장해 드립니다.
3. Kit에 포함되어 있는 시약 보관 온도가 왜 다 다른가요?
10X topo II buffer의 경우 ATP가 포함되어 있기 때문에 잦은 냉동/해동을 반복할 경우 buffer가 불황성화 되고, 또한 kDNA substrate, supercoiled DNA substrate의 잦은 냉동/해동은 DNA가 degradation 되기 때문입니다.
4. Topoisomerases가 비활성일 경우, 어떻게 해야 하나요?
Topoisomerase의 활성이 낮은 이유는 다양합니다. 오염으로 인하여 enzyme 활성이 낮아진 경우, piptte error나 기술적인 문제가 있는 경우가 있습니다. 또한 Buffer의 냉동/해동으로 인해 buffer가 degradation이 된 경우가 있습니다. 이와 같은 문제가 발생시, 다음과 같은 방법으로 재 실험 진행 후 문의 주시기 바랍니다.
1. 20-30 uL의 Rection volume에 enzyme의 양을 1-4 uL로 조절하여 test 해보시길 권장 드립니다.
2. Buffer가 가끔 완충제 역할을 잃어 효소 활성에 제 역할을 하지 못하는 경우가 발생하기 때문에 buffer를 다시 만들어 보는 것을 권장해 드립니다.
3. Gel run 할 경우 marker (e.g. linear, supercoiled plasmid 등)와 함께 하고, stock enzyme의 양은 rection volume의 10%를 넘기지 않을 것을 권장 합니다.
4. Plasmid DNA의 relacation을 분석할 경우, gel을 running 할 때 EtBr를 넣는 것 보다 running이 끝난 후 EtBr로 염색하여 이미지를 확인하는 방법을 권장 합니다. (running 후 EtBr 염색하여 이미지를 확인하는 것이 분석에 적합한 이미지를 얻을 수 있기 때문입니다.)
5. Topo/DNA cleavege 검출을 위한 약물 screening kit에 필요한 enzyme 양은 얼마인가요?
Enzyme은 보통 2 uL가 필요합니다. 하지만 LOT 마다 activity의 차이가 있을 수 있으며, enzyme 활성이 높은 LOT의 경우 1uL 사용도 가능합니다.
6. Topoisomerase ICE assay kit 와 Topoisomerase Drug Screening Kit의 차이는 무엇인가요?
Topoisomerase Drug Screening Kit는 Topoisomerase의 작용에 대해 억제나 활성을 갖는 potential compound를 스크리닝하는 제품입니다. Human Topoisomerase ICE Assay Kit는 In vivo Complex of Enzyme (ICE) 으로 live cell에서 covalent topo/genomic DNA complexes를 검출하는 제품입니다.
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