[R&D Systems] Fluorokines | 형광염료가 결합된 활성 단백질 | 고마바이오텍

특징 

• 형광 라벨이 부착된 재조합 단백질로, 세포 표면의 수용체와 직접 결합하는 리간드 역할을 하여, 항체 없이 직접 타겟에 결합하면서 형광신호를 발생시킵니다.  따라서 더 간단하고, 비특이적 결합도 줄고, 실험 시간이 짧아집니다.
• CAR-T/NK 세포, 면역관문 수용체 세포, SARS‑CoV‑2-관련 cell interaction 분석 등에서 유용하게 사용됩니다.
• Alexa Fluor® 형광염료를 사용하여 강한 형광 신호와 뛰어난 광안정성(photostability)을 제공합니다.
• 라벨링 전 단백질의 기능이 유지되며, lot 간 차이 없이 일관된 품질을 보장합니다.

• CAR‑T / CAR‑NK 세포에서 CAR 발현 측정

유전적으로 형질전환된 T·NK 세포가 CAR (Chimeric Antigen Receptor)를 발현하고 있는지 확인할 때, Fluorokine을 이용해 CAR에 직접 결합시켜 FACS로 분석합니다. 보조 항체를 쓰는 간접 방법 없이, 한 단계 직접 염색만으로 CAR‑양성 세포를 간단하게 식별하고 정량화할 수 있습니다.

Fluorokine을 활용한 CAR-T 또는 CAR-NK 세포에서의 CAR 발현 직접 확인

(A) CAR-T 세포 치료는 T 세포에 특정 항원을 인식하는 CAR을 도입하여 종양 세포를 공격하게 하는 방식입니다.

(B) CAR-T 세포를 만들고 난 뒤, CAR이 잘 발현되었는지 확인하는 과정이 중요하며, 이때 형광이 표지된 항원 단백질(Fluorokine)을 이용해 CAR 발현 세포를 직접 염색할 수 있습니다.

BCMA	CD19	CD30/TNFRSF8	CD40/TNFRSF5	CD300e/LMIR6	DLL3
EGF R	EMMPRIN/CD147	EpCAM/TROP1	ErbB2/Her2	Fc gamma RIIA/CD32a (R167)	Fc gamma RIIIA/CD16a
Glypican 3	IL-13 R alpha2	Mesothelin	MUC-1	OX40	PD-1
Siglec-2/CD22	Siglec-3/CD33	TRAIL R2	TSLP R	VEGFR2/KDR

• 면역관문 수용체 (Immune Checkpoint) 분석

PD‑1, PD‑L1, B7‑1/CD80, PD‑L2 등 면역관문(receptor)을 발현하는 세포를 식별하거나 분리하고자 할 때, 이에 대응하는 형광 표지된 리간드를 사용해 직접 염색하고 분석 가능합니다.

Fluorokine을 활용한 면역관문 상호작용 탐색과 면역치료제 연구

(A) 면역관문 리간드와 수용체 간의 상호작용은 일반적으로 항원제시세포(APC)가 PD‑L1 또는 PD‑L2 같은 리간드를 발현하고, T 세포가 PD‑1과 같은 수용체를 발현하는 방식으로 이루어집니다. 이처럼 수용체와 리간드가 결합하게 되면 세포 내 신호전달 경로가 활성화되며, 이 신호는 세포 반응을 억제하거나 활성화하는 역할을 합니다. 예를 들어, PD‑1이 결합하는 경우에는 T 세포의 활성화가 억제되어 면역반응이 감소하게 됩니다.  (B) 이러한 면역관문 단백질 상호작용 연구에 Immune Checkpoint Fluorokine(형광 표지된 면역관문 단백질)을 활용하면, 연구자들은 면역 반응의 기전을 더 잘 이해할 수 있으며, 특정 면역세포를 분리하거나 면역관문을 차단하는 새로운 면역항암제의 효과를 평가할 수 있습니다. Fluorokine을 통해 면역관문 리간드-수용체 결합을 실시간으로 시각화하고 분석함으로써, 면역치료제의 타깃 정확도와 작용 효율을 검증할 수 있게 됩니다.

 

B7-1/CD80	B7-2/CD86	B7-H2	B7-H3	B7-H4	CD155/PVR
GITR Ligand/TNFSF18	HVEM/TNFRSF14	IgG1	PD-L1/B7-H1	PD-L2/B7-DC	SIRP alpha

• SARS‑CoV‑2 스파이크 단백질 관련 연구

스파이크 단백질 전체나 RBD (receptor binding domain), 그리고 다양한 변이체(Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron 등)에 라벨을 붙여, ACE-2 수용체가 발현된 세포에 바이러스 결합 여부를 FACS로 확인, 항체나 작은 분자의 중화 효과 탐색, 면역 반응 연구 등에 활용합니다. 

SARS-CoV-2 연구를 위한 Fluorokine 활용 

(A) SARS-CoV-2의 Spike 단백질과 숙주 세포 수용체인 ACE-2의 결합은, 바이러스가 세포에 침투할 때 핵심적인 역할을 하므로 치료제 개발의 주요 표적이 됩니다.

(B, C) 형광으로 표지된 Spike 단백질 또는 ACE-2 수용체를 이용하면, 바이러스 결합 세포를 식별할 수 있으며, 면역 반응 연구나 Spike-ACE-2 상호작용을 방해할 수 있는 물질 탐색에 활용됩니다. 

데이터

CD19‑CAR T 세포를 검출하기 위해 두 가지 방법을 비교한 실험에서, 형광이 표지된 recombinant human CD19 단백질(Atto 647N Fluorokine)과 anti-idiotype 항체(FMC63 scFv)를 사용한 결과가 유사하다는 것이 확인되었습니다. 유전자 편집을 통해 CD19-CAR을 도입한 T 세포들은, flow cytometry를 이용하여 CAR의 발현 여부를 분석하였습니다. 이를 위해 하나의 그룹은 Atto 647N 형광염료가 결합된 재조합 CD19 Fc 단백질(#ATM9269)을 사용해 염색하였고, 다른 그룹은 Biotin이 결합된 단일클론 anti-FMC63 항체를 이용한 뒤, PE로 표지된 streptavidin을 처리하는 방식으로 염색하였습니다. 

그 결과, 두 방법 모두 CD19‑CAR을 효과적으로 검출했으며, 염색 효율은 서로 유사한 수준이었습니다. 이는 형광 표지된 CD19 단백질을 이용한 직접 염색 방식이, 전통적인 항체 기반의 간접 염색 방식에 비해 간단하면서도 충분히 신뢰할 수 있는 대안이 될 수 있음을 보여줍니다. 

형광 표지된 재조합 단백질(PD-L1 또는 B7-1)의 특이성과 결합능 확인

(A) Streptavidin으로 코팅된 비드에 Biotin으로 표지된 anti-PD-L1 (B7-H1) 단클론 항체를 결합시킨 후, 해당 비드를 R&D Systems의 Recombinant Human PD-L1/B7-H1 His-tag Alexa Fluor® 647 단백질 (Catalog # AFR9049)을 다양한 농도로 처리하여 염색합니다. 이 실험은 표지된 PD-L1 단백질이 anti-PD-L1 항체에 특이적으로 결합하는지를 분석하는 데 사용됩니다. 

(B) 마찬가지로, Streptavidin으로 코팅된 비드에 Biotin으로 표지된 anti-B7-1 (CD80) 단클론 항체 (R&D Systems, Catalog # BAM1402)를 결합시킨 후, 해당 비드를 다양한 농도의 Recombinant Human B7-1/CD80 His-tag Alexa Fluor® 647 단백질 (R&D Systems, Catalog # AFR9050)로 염색합니다. 이 실험은 B7-1 단백질이 해당 항체에 특이적으로 결합하는지를 분석하는 데 사용됩니다.

Alexa Fluor®로 표지된 스파이크 단백질을 이용한 HEK293 세포의 ACE-2 발현 검출

HEK293 세포에 인간 ACE-2 유전자를 형질도입한 후, 이 세포들을 두 가지 조건으로 처리하였습니다. (A) 조건에서는 Alexa Fluor® 488 형광염료가 결합된 His-tag 스파이크 단백질(Recombinant SARS-CoV-2 Spike [GCN4-IZ], #AFG10561)을 1 µg/mL 농도로(100 µL/well) 처리하여 염색하였고, (B) 조건에서는 염색을 하지 않은 세포(unstained)를 대조군으로 사용하였습니다. 그 결과, 형광 스파이크 단백질로 염색한 세포군에서는 거의 모든 세포가 ACE-2 양성으로 나타났으며, 이는 염색하지 않은 대조군에 비해 뚜렷하게 높은 ACE-2 발현을 보여주었습니다. 즉, 형광 표지된 스파이크 단백질을 통해 ACE-2 발현을 효과적으로 검출할 수 있음이 입증되었습니다.