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유전독성 시험을 위한 Comet Assay Kits

OxiSelect™ Comet Assay Kit는 Single Cell Gel Electrophoresis assay를 통해 세포의 DNA 손상을 측정하는 Assay Kit 입니다.

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특징

 

  • DNA 손상은 환경적 요인과 세포 내 정상적인 대사 과정으로 발생합니다. 중요 유전자에 생긴 손상이 복구되지 않으면 세포가 정상 기능을 수행하는 능력을 방해할 수 있고 암 발생 가능성을 유의하게 증가시킬 수 있습니다. 
  • Comet assay는 다양한 형식의 DNA 손상에 대해 Single cell gel electrophoresis assay 방법으로 스크리닝합니다.
  • 전류가 흐르는 동안 손상된 DNA는 "comet (혜성)" 모양을 형성하며, Epifluorescence microscopy로 확인한 결과 건강한 DNA와 시각적으로 구분됩니다.
  • 96-well 혹은 3-well 형식으로 제공됩니다.
  • low-melting agarose의 경우 Slide 형식을 이용하여 분석하실 수 있습니다.


실험 과정 





실험 결과


Etoposide Treatment of Jurkat Cells. Jurkat cells untreated (left) and treated (right) with Etoposide before performing OxiSelect™ Comet Assay under 
alkaline electrophoresis conditions at 33V / 300 mA for 15 minutes.



Epifluorescence Microscopy Visualization of DNA Damage using the OxiSelect™ Comet Assay Kit. 


자주 묻는 질문 

Q1. Comet assay로 어떤 손상을 감지할 수 있나요? 
이중 가닥 및 단일 가닥의 손상, AP site로 인한 변화를 측정할 수  있어 DNA 손상의 전반적인 상태를 보여줍니다. 검출 가능한 DNA 종류는 assay에서 선택하는 running buffer에 따라 달라집니다. TBE buffer는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 절단과 일부 AP site를 검출할 수 있게 해줍니다. Alkaline buffer는 이러한 항목들과 더불어 AP site와 더불어 alkali labile DNA adduct까지 검출합니다. 

Q2. 이 assay의 검출 한계 (Limit of Detection)는 어느 정도인가요? 
Comet assay는 diploid mammalian cell 1개 당 약 50개의 절단까지 감지할 수 있을 정도로 민감합니다. 다만 결과는 보통 tail moment와 tail DNA%로 제시됩니다. (제품 매뉴얼 8페이지 참고)

Q3. Comet Slide 전체를 한 번에 다 사용해야 하나요? 
Comet slide는 표면이 treat되어 있으며, 전체가 denaturation, electrophoresis, washing 단계에 한번이라도 들어가면 다시 사용할 수 없습니다. 96-well comet slide는 한 번에 전체를 사용하도록 설계되었습니다. 

Q4. Agarose gel이 slide에서 떨어지는 것을 어떻게 방지하나요?
Comet slide는 agarose를 고정하도록 접착성 표면으로 화학 처리되어 있습니다. Gel이 밀려 떨어지는 문제는 대게 agarose-cell suspension을 well에 올릴 때 완전히 덮이지 않아서 생깁니다. Gel은 well 전체를 덮도록 고르게 펴 발라야 합니다. Agarose gel이 slide에 단단히 부착되려면 제품 매뉴얼 6페이지의 4번 단계가 매우 중요합니다. 또한 전 과정에서 슬라이드는 항상 수평으로 유지하는 것이 중요합니다. 

Q5. 일반 현미경 slide로 OxiSelect™ Comet Assay Kit를 시험해볼 수 있나요? 
아니오. 일반 현미경 slide는 comet assay에 사용할 수 없습니다. 일반 slide는 사전 처리가 되어있지 않아 agarose-cell suspension이 제대로 고정되기 어렵습니다. 

Q6. 대조군 세포의 손상은 어떻게 최소화할 수 있나요? 
모든 세포는 어느 정도 DNA 손상을 보이며, 검출된 손상은 내인성 수준일 수 있습니다.  Harvest 과정에서 생기는 손상이라면, 두 세포 집단을 동시에 같은 조건에서 분리해야 합니다. 또한 샘플 준비 과정에서의 DNA 손상을 최소화하도록 설계된 매뉴얼 6페이지의 샘플 준비 절차를 따르는 것을 권장합니다. 실험 조건은 전기 영동 시간을 더 짧게 하는 방식으로 최적화할 수도 있는데, 이렇게 하면 처리군의 tail은 유지하면서 대조군의 tail을 더 짧게 만들어 background를 줄일 수 있습니다. 

Q7. 좋은 Positive Control은 무엇인가요? 
Etoposide 20 µM로 세포를 4시간 처리하여 comet tail을 만듭니다. 또한 처리된/처리되지 않은 Comet Assay Control Cells도 제공합니다. 

Q8. 세포가 slide의 agarose에 들어있는 이후에는 낮은 조도에서 실험해야 하나요? 
UV 노출을 최소화하기 위해 샘플을 덮어서 보호하는 것을 권장합니다. UV는 추가적인 DNA손상을 유발할 수 있어 background가 높아질 수 있습니다. 샘플 준비 시에는 이러한 과정이 중요하지만 전기 영동 자체는 덮지 않고 진행해도 괜찮을 가능성이 큽니다. 또한 Vista Green 염료는 빛에 민감하므로 반드시 빛을 차단해 보호해야 합니다. 

Q9. 300 mA를 유지하려면 전류를 어떻게 조절하나요? 
전류 유지에는 전기영동 탱크 안의 buffer 부피가 영향을 줍니다. 일반 gel을 돌릴 때처럼 탱크를 가득 채우는 대신, buffer 높이가 처음에는 slide를 간신히 덮을 정도로 시작해야 합니다. 그런 다음 300 mA가 유지되도록 buffer 높이를 조금씩 조정합니다. 이 전류를 유지하는데 많은 buffer가 필요하지 않습니다. 

Q10. Vista Green 염료에 담근 상태로 slide를 얼마나 보관할 수 있나요? 
형광이 줄지 않도록 빛을 차단한 상태로 4ºC에서 최대 3개월 보관할 수 있습니다. 다만 결과 분석은 가능한 염색한 당일에 하는 것을 권장합니다. Vista Green으로 염색하지 않고 건조된 슬라이드는 1년까지 보관할 수 있습니다.

Q11. 이 assay에 사용할 수 있는 DNA 손상 유발 물질에 대한 참고 값이 있나요? 
ELISA와 달리 Comet assay는 실험 조건에 따라 결과가 달라지기 때문에 reference control을 제공하지 않습니다. 예를 들어, 동일한 DNA 손상을 가진 세포라도 전기영동 조건이 다르면 tail의 크기가 달라질 수 있습니다. 조건이 완전히 동일할 수 없기 때문에 다른 연구자의 결과와 직접 비교하는 것은 의미가 없을 수 있습니다.  화합물이 DNA 손상에 미치는 영향을 시험하려면, 모든 조건을 시험 간에 동일하게 유지하고, 동일한 running 시간과 동일한 분석 소프트웨어를 사용해 비교하는 것을 권장합니다. 


사용 논문

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