1. Comet assay로 어떤 DNA 손상을 확인할 수 있나요?
Comet assay는 DNA의 이중 가닥 및 단일 가닥, AP site로 인한 변화를 측정할 수 있기 때문에
전반적인 DNA 손상을 확인할 수 있습니다. 분석을 위해 사용된 running buffer에 따라, TAE 버퍼는 단일가닥과 이중가닥 파손 및 일부
AP site를 감지할 수 있고, alkaline buffer는 이 외에도 AP site와 알칼리에 깨지기 쉬운 DNA adducts도 감지합니다.
2. Comet assay의 민감도는 어느 정도인가요?
Diploid mammalian cell 당 50개 손상을 감지할
수 있을 정도로 민감하지만, 결과는 일반적으로 tail moment와 tail DNA%로 표현됩니다. (제품 매뉴얼 8페이지를 참고하세요). 감지될 수 있는 DNA 손상은 분석을 위해 선택된 running buffer에 따라
다릅니다. ELISA와 달리, 실험조건에 따라 변수가 다르기
때문에 Comet assay는 control을 제공하지 않습니다. 예를
들면 동일한 양의 DNA 손상을 포함하는 세포는 전기영동을
running하는 조건에 따라 tail 사이즈가 달라집니다.
3. Comet slide는 한번에
사용되어야 하나요?
Comet slide는 표면이 처리되어 있기 때문에 변성, 전기영동, 세척의 과정을 거치면
다시 사용할 수 없게 됩니다. 96개의 well은 한번에
사용되도록 설계되었습니다.
4. 슬라이드에서 아가로스젤이 떨어지는
것을 어떻게 방지할 수 있을까요?
Comet Slide는 아가로스를 제자리에 고정하도록
설계되어 접착 표면을 화학적으로 처리하게 됩니다. 아가로스-세포
현탁액이 슬라이드에 처리될 때 완전히 덮여지지 않으면 떨어지게 됩니다. Comet Slide에 아가로스
젤이 제대로 붙도록 확실히 하기 위해서는 메뉴얼 6페이지의 step 4 과정이 매우 중요합니다:
세포 시료를 Comet Agarose에 1:10 비율로 잘 혼합하고, 바로 OxiSelect™ Comet Slide 한 well 당 75 µL를 파이펫으로 넣어주세요. 파이펫 끝으로 현탁액이 완전히 퍼뜨려지도록 확실히 하세요.
모든 과정 중에 슬라이드가 수평으로 유지되는 것도 매우 중요합니다.
5. OxiSelect™ Comet Assay Kit를 일반 현미경 슬라이드를 이용하여 예비 실험을 해도
괜찮을까요?
아니요. Comet Assay는 일반 현미경에서는
사용할 수 없습니다. Comet Slide는 접착력을 높이기 위하여 화학적으로 사전처리 되었습니다. Cell/Agarose 방울은 일반 슬라이드에서 고정될 수 없습니다.
6. 대조군 세포의 손상을 최소화하려면
어떻게 해야 하나요?
단일세포 전기영동 (single cell gel electrophoresis / SCFE) 분석으로도
알려진 Comet Assay는 단일 세포 현탁액의 DNA 손상을
측정합니다. 모든 세포에는 약간의 DNA 손상을 보이고, 검출된 양은 내인성 수준입니다. 채취 후 손상된 경우, 두 세포군 동시에 동일 조건에서 분리하는 것이 중요합니다. 샘플 준비에 의한 DNA 손상을 최소화하기 위해 매뉴얼 6페이지에 기재된 샘플 준비 방법을 잘 따르는 것 중요합니다. 분석 조건은 짧은 시간 내에 전기영동을 진행하여 최적화될 수 있으며, 처리된 세포의 꼬리를 유지하되 대조군 세포의 꼬리는 짧게 생성해야 합니다.
7. Positive control은 어떻게 준비하나요?
4시간 동안 20uM etoposide을 세포에 처리하여 Comet tail을 만든 Control cell과 처리되지 않은 Comet
Assay Control Cell을 준비합니다.
8. 슬라이드 위 아가로스 젤에 세포를 처리한 이후부터는 낮은 조명에서 실험하는 것이 필요할까요?
자외선에 노출되면 추가적인 DNA 손상이 유도되고 높은 백그라운드를 야기할 수 있으므로 샘플 준비 중에는 UV 노출에 최소화되도록 합니다. 전기영동 중에는 덮지 않아도 됩니다. Vista
Green dye는 빛에 민감하므로 차광하여야 합니다.
9. 300mA로 전류를
유지하려면 어떻게 해야 하나요?
전류를 유지하는 것은 전기영동 탱크 내의 버퍼 부피에 영향을 받습니. 버퍼로 탱크를 완전히 채우는 대신 슬라이드를 덮는 정도로 시작하고, 전류가 유지되도록 버퍼 양을 조정합니다.
10. Vista Green dye로 처리된 슬라이드는 얼마나 오래 보관할 수 있을까요?
Vista Green으로 염색된 슬라이드는 4ºC 어두운 조건에서 3개월 동안 형광이 유지됩니다. 결과를 분석하는 당일에 슬라이드를 염색하는 것을 권장합니다. 건조되거나 Vista Green으로 염색되지 않은 슬라이드는 1년간 보관할 수
있습니다.
11. Comet 분석시 사용할 수 있는 DNA damage의 reference value가 있나요?
ELISA와 달리, 실험조건에 따라
변수가 다르기 때문에 Comet assay는 control 결과를 제공하지 않습니다. 예를 들면 동일한 양의 DNA 손상을 포함하는 세포는 전기영동을 running하는 조건에 따라 tail 사이즈가 달라집니다. 조건이 동일하지 않기 때문에 다른 결과와 비교하는 것은 의미가 없습니다. DNA 손상에 대한 화합물의 영향을 확인하고 싶다면, 모든 실험
조건을 일관되게 유지하고 분석을 위해 동일한 실행 시간과 소프트웨어를 사용하는 것을 권장합니다.
*
제품에 대한 상세 내용은 아래 추천 제품을 클릭해 주세요.