1. Biolaminin을 어떻게 사용해야 하나요?
Biolaminin 용액으로 배양 용기를 코팅해야 합니다. 우선, 해동된 laminin 원액을 1xDPBS(Ca2+/Mg2+)로 희석한 뒤 배양 용기에 넣습니다. 증발을 방지하기 위해 parafilm등으로 밀봉합니다. 2-8도에서 하룻밤 배양하거나 37도에서 2시간동안 배양합니다. 코팅되지 않은 과다한 laminin은 없애고 cell suspension을 well에 분주합니다. washing 과정은 필요하지 않습니다. 코팅된 plate나 희석된 코팅용액을 바로 사용하지 않을 경우에는 최대 4주동안 2-8도에서 보관할 수 있습니다. 코팅된 표면이 탈수되지 않도록 주의합니다.
2. Biolaminin에서 키운 hPSC를 해동할 때 회수율은 어떻게 되나요?
Biolaminin으로 처리된 세포의 생존율은, colony보다는 single cell로 동결 및 해동될 때 회수율이 현저하게 높습니다. (Miyazaki et al., 2013)
3. Biolaminin에 cell seeding 후, 세포가 고르지 않게 spread된다면 이유는 무엇인가요?
코팅 농도가 너무 낮거나 코팅이 충분히 되지 않았을때 그런 현상이 발생할 수 있습니다. Stock solution 만들때 DPBS Ca2+/Mg2+를 사용해야 합니다. 코팅이 전체적으로 잘되어 있지 않거나, 인큐베이터에 너무 오래 둘 경우 증발이 많이 되어 종종 가운데부터 plate가 말라버렸을 수도 있습니다.
4. PSC를 feeder cell이나 feeder-free culture substrate에서 laminin으로 교체할때 세포가 잘 부탁이 되지 않는 경우가 있습니다. 어떻게 해결해야 할까요?
세포를 single cell이나 small clump 타입으로 옮기고, 처음 3-5 passage 동안에는 ROCKi와 같은 apoptosis inhibitor를 첨가합니다. 일단 세포가 Biolaminin matrix에 적응하게 되면 최대 5 passage까지는 ROCKi없이 single cell로 배양합니다. 세포가 적응을 잘 안할경우에는 코팅 농도를 10ug/ml까지 늘이고 cell density도 50K-100K cells/cm2 정도로 높입니다. Biolaminin521은 대부분의 시중에 판매되는 media와 함께 사용할 수 있습니다. 그렇지만 cell morphology는 media에 따라 달라질 수 있습니다.
5. Biolaminin 농도를 높이고 코팅 시간을 줄여도 될까요?
권장하지 않습니다. 코팅은 37도에서 적어도 2시간 이상은 해야 합니다. 코팅이 충분하지 않으면 cell 부착과 생존에 영향을 주기 때문입니다. 코팅 농도를 높임으로써 발생할 수 있는 variation을 고려해야 합니다.
6. 코팅된 Biolaminin은 얼마동안 유지되나요? 장기간 배양하려면 추가로 laminin을 더 넣어야 하나요?
Biolaminin 코팅은 적어도 한달간 기능을 유지합니다. 장기간 배양시, 세포가 떨어지면 1-5ug/ml의 별도 laminin을 medium에 추가합니다.
7. 코팅 용액은 재사용해도 되나요? 코팅 농도는 어떻게 정하나요?
오염 및 코팅 농도 문제가 있으므 재사용은 하지 않는것이 좋습니다. titration을 통해 최적의 코팅 농도를 평가합니다. 이때 권장 시작 농도보다 낮은 농도를 사용합니다. Biolaminin521을 hESC나 iPSC에 이용할 경우 5ug/ml이 효과적입니다. MSC 및 신경응용 분야의 경우, 1ug/ml 정도의 낮은 코팅 농도가 효과적일 수 있습니다. 최적의 코팅 농도는 세포유형에 따라 다릅니다.
8. Biolaminin을 유리등의 다른 표면에도 사용할 수 있나요?
네 가능합니다. 유리에 사용해도 세포의 부착과 세포 기능 유지에 좋은 결과를 보여줍니다. Glassware에 코팅할 때 2-8도에서 24-48시간 코팅하는 것이 좋습니다. (Miyanari et al., 2013)
9. Biolaminin 코팅 농도가 세포의 특성에 영향을 주나요?
농도가 너무 낮으면 세포가 천천히 자라고, 고르지 않게 spread 됩니다.
10. Biolaminin LN, MX, CTG의 차이는 무엇인가요?
CTG는 Cell Therapy Grade로, 임상연구에 사용할 수 있도록 더 많은 quality control report를 제공합니다. MX와 CTG는 animal origin-free to the secondary level로, LN은 animal origin-free to the primary level로 공급됩니다.
11. 각 Biolaminin의 MW은 어떻게 되나요?
12. Biolaminin은 purificaton tag을 갖고 있나요?
alpha 4와 5 chain이 있는 LN521, LN511, LN421, LN411은 NT에 FLAG-tag을 갖고 있습니다. alpha2 chain이 있는 LN211은 NT에 HA-tag을 CT에 FLAG-tag을 갖고 있습니다. LN111, LN121, LN221, LN332는 tag이 없습니다. Cell Therapy grade인 Biolainin 521 (CT521)과 MX521은 tag이 없습니다.
13. Biolaminin의 purity는 어떻게 되나요?
SDS-PAGE에서 95%의 purity를 가집니다.
14. 조직에서 추출한 laminin에 비해 Human recombinant laminin의 주요 장점은 무엇인가요?
조직에서 추출된 laminin은 여러 ECM 단백질이 섞여 있고, 분리하는 동안 단백질의 구조적 완전성과 기능이 상실되거나 분해될 수 있고, 이러한 laminin은 세포가 적절하게 세포외 matrix network을 형성하는데 필요한 도메인이 부족합니다. 따라서 손상되지 않은 전체길이의 laminin이 모든 기능적 도메인이 온전하게 작용함으로써 보다 확실하게 세포 배양 환경을 만들 수 있습니다.
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