1. TrueBlack Background Reducer의 종류와 사용 용도를 알려주세요.
TrueBlack Background Reducer는 western blot이나 immunofluorescence 염색시, 항체와 dye간의 비특이 반응을 막아주거나, 조직이나 세포에 축적되어 있는 지방 갈색소인 lipofuscin이 방출하는 자가형광을 소멸시킴으로서 비특이 반응이나 백그라운드 형광을 차단시키기 위한 시약입니다.
TrueBlack 라인의 제품으로는, 형광을 이용한 WB 실험에 이용되는 TrueBlack® WB Blocking Buffer Kit (#23013), 면역형광염색에 사용되는 TrueBlack® IF Background Suppressor System (#23012), lipofuscin 자가형광을 소멸시키는 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quenchers (#23007)와 수용성인 TrueBlack® Plus Lipofuscin Autofluorescence Quencher (#23014)가 있습니다.
2. TrueBlack® WB Blocking Buffer는 어떤 종류의 membrane에 이용할 수 있나요?
PVDF 와 nitrocellulose membrane에 모두 사용할 수 있습니다.
3. TrueBlack® WB blocking Kit를 사용시 유의할 사항이 있나요?
HRP-conjugated antibody를 사용하는 chemiluminescence에는 사용하기 적합하지 않습니다. CF® dye가 라벨링된 2차 항체를 사용할 때는, WB Antibody diluent에서 1:20,000의 비율로 희석하여 최종 농도가 0.1ug/mL가 되는 것을 권장합니다.
4. TrueBlack® Lipofuscin Quenchers는 세포 투과성인가요? 그리고 살아있는 세포에 사용될 수 있나요? 유세포분석기에 사용된 적이 있나요?
TrueBlack® Lipofuscin Quenchers는 세포막 투과적이며, 낮은 농도에서는 독성을 갖지 않습니다. 살아있는 세포에서
염료는 리소좀이나 세포내 소포체에 축적됩니다. 따라서, 특정
세포 타입에서 자가 형광과 대상 프로브의 출처와 위치에 따라 유세포 분석기 또는 현미경 검사에서 live ell의 자가형광을 퀜칭하는 것이 유용할
수도, 유용하지 않을 수도 있습니다.
TrueBlack®Plus Lipofuscin Autofluorecence Quencher의 경우, 조직 박편의 퀜칭에 사용한 것보다 살아있는 세포에 사용할 때의 농도는 0.001배에서 0.005배 정도로 훨씬 낮습니다. 세포 배양은 배지에서 30분에서 며칠까지 가능하나, 독성은 세포 유형에 따라 다릅니다.
TrueBlack®Lipofuscin Autofluorecence Quencher는 수용성 버퍼나 세포 배지에서 용해되지
않으므로, 살아있는 세포를 염색하는 데는 적절하지 않습니다. 대신 TrueBlack®Plus Lipofuscin Autofluorecence Quencher를 이용합니다.
5. TrueBlack®IF Suppressor (Permeabilizing) kit는 TrueBlack® Lipofuscin Quenchers와 호환
가능한가요? 간접 면역 형광 염색을 위해 함께 사용 가능할까요?
TrueBlack® Lipofuscin Quenchers는 TrueBlack® IF Background Suppressor
(Permeabilizing) kit와 함께 사용하여 비특이적 항체결합과 염료 결합으로 인한 백그라운드와 자가 형광을 줄일 수 있습니다. 다만 TrueBlack® IF
reagent는 세제를 함유하고 있으므로, 둘을 함께 사용한다면 면역 염색 후에 TrueBlack® lipofuscin quencher를 사용해야 합니다.
6. TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quenchers는 in situ hybridization에도 사용할 수 있나요?
TrueBlack® Lipofuscin quencher는
in situ hybridization에 사용할 수 있습니다. 아래 링크를 참고하세요.
7. TrueBlack® Lipofuscin Quenchers와 함께 사용할 수 있는 mounting media는 어떤것이 있을까요?
TrueBlack® lipofuscin quencher 는 수성 mounting media를 사용하여 봉입해야
합니다. Permount™ 나 DPX 같은 유기 용제 기반 mounting media와 함께 사용할 수 없습니다.
TrueBlack® lipofuscin quencher는 아래의 mounting media(DAPI 포함 또는 제외)와 호환됩니다.
- EverBrite™
Mounting Medium
- EverBrite™
Hardset Mounting Medium
- Slowfade®
Gold(Thermo Fisher Scientific)
- Prolong®
Gold(Thermo Fisher Scientific)
- VECTASHIELD®(Vector
Laboratories)
- VECTASHIELD®
Hardset(Vector Laboratories)
- Fluoromount-G®(Southern
Biotech)
- Fluoromount™(Sigma
)
8. TrueBlack® Plus와
함께 사용할 수 있는 mounting media는 무엇인가요?
최고의 결과를 위해 EveBrite™
Mounting Medium과 같은 글리세롤 기반의 젖은 mounting media를 사용하여 샘플을 봉입하는 것을 권장합니다.
이 외에도 TrueBlack®Plus
처리된 샘플을 봉입하는데 이용될수 있는 mounting media는 다음과 같습니다.
- SlowFade®
Gold (Thermo Fisher Scientific)
- SlowFade®
Diamond (Thermo Fisher Scientific)
- Prolong®
Diamond (Thermo Fisher Scientific)
- Prolong®
Glass (Thermo Fisher Scientific)
- Vectashield®
Hardset (Vector Laboratories)
- Vectashield®
Vybrance™ (Vector Laboratories)
- Fluoromount-G® (SouthernBiotech)
- Mowiol®-based
mounting medium (Kuraray Europe GmbH)
아래의 mounting media에는 사용을 권장하지 않습니다.
- Vectashield®
wet-set medium (Vector Laboratories)
- Fluoroshield (ImmunoBioScience Corp)
9. TrueBlack® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 처리된 샘플에 군집이나 침전이 관찰된다면 무엇을 해야 할까요?
TrueBlack® lipofuscin quencher는 친수성입니다. 특정 실험적 조건은 처리된 샘플에서 퀜처를 침전하게 하거나 군집을
만들어 이미징을 방해할 수 있습니다. 이런 현상을 예방하기 위하여
20배 농도의 DMF에서 70ºC로 5분간 TrueBlack® stock solution을 가열해줄 것을 권장합니다.
10. TrueBlack®이나 TrueBlack®Plus Lipofuscin Autofluorescence Quencher는 BODIPY나 LipidSpot® 같은 지방 방울 염색과 호환 가능한가요?
TrueBlack® 및
TrueBlack® Plus는 본질적으로 소수성이고, 주로 소수성 상호작용을 통해 리포푸신
자가형광을 소멸시킵니다. 따라서 지질 구조를 염색시키고 지질 구조에 결합하고 BODIPY나 다른 지질 방울 염료의 형광신호를 소멸시킵니다. 또한, original TrueBlack® #23007은 지질 방울형태를 방해하고 염색에 영향을 끼칠 수 있는 70% 에탄올에서 사용될 수 있습니다. TrueBlack® Plus #23014는 70% 에탄올이 아닌 버퍼에서 사용될 수 있으며 지질방울 염색과 함께 하기 적절합니다. 하지만, TrueBlack® Plus의 결합은 소수성 결합에 의존적이
때문에, 샘플 유형에 지방방울 염색한것과 TrueBlack® Plus를
전처리 또는 후처리 한 것이 호환 가능한 지 먼저 확인하시는 것을 권장합니다.
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