1. Apoptosis and Necrosis Quantification Kit는 어떤 실험에 이용되나요?
세포막의 PS(Phosphatidylserine)에 결합하는 Annexin V를 이용하여 apoptosis를 확인하고 (FITC에 의해 Green 형광을 나타냅니다.) Nucleic Acid Probe인 Ethidium Homodimer III (EthD-III) 통해 necrosis를 확인합니다. EthD-III는 기존의 propidiumiodide(PI) 혹은 Ethidium Homodimer 보다 강한 Affinity와 형광능을 가지고 있습니다. Apoptotic cell은 green 형광, Necrotic cell은 red 형광으로 보여집니다. Late apoptotic cell은 red와 green 모두 염색 됩니다.
2. 실험 결과는 어떻게 확인되나요?
현미경이나 Flow cytometry를 통한 결과확인이 가능합니다. Apoptotic cell은 그린형광으로 보여지며, necrotic cell은 레드형광으로 보여집니다. Late apoptotic cell은 레드, 그린형광을 모두 염색됩니다.
3. 염색 후, 세포 고정이 가능한가요?
염색 후, 포름알데하이드를 이용한 세포 고정이 가능합니다. Annexin V 는 Calcium-dependent 하기 때문에, fixation과 washing에 사용되는 buffer는 1.25mM CaCl2가 포함되어야 합니다. Fixation이 EthD-III signal의 background 증가에 영향을 미칠 수 있으므로, Fixation 전에 충분한 Washing이 필요합니다.
4. Fix된 세포나 조직으로도 실험이 가능한가요?
Fixation, freezing, sectioning은 세포막의 PS (phosphatidylserine)에 영향을 주기때문에, 샘플로 적합하지 않습니다. 고정된 세포나 조직에서 apoptosis를 검출하실 경우, TUNEL Kit (Cat. No. 30063, Cat. No. 30064) 사용을 권장합니다.
5. AnnexinV는 어떤 species에 사용할 수 있나요?
AnnexinV는 35kD calcium-dependent phospholipid binding protein으로 PS에 강한 affinity를 가지고 있습니다. 그렇기 때문에 species-specific 하지 않습니다.
6. 살아있는 배아나 체외배양조직으로 실험이 가능한가요?
이 제품은 배양된 dissociated cell의 assay를 위해 고안된 제품입니다.
7. Binding buffer의 역할은 무엇인가요?
Kit에 제공되는 Binding Buffer는 Annexin V가 PS (phosphatidylserine)에 결합하는데 필수적인 칼슘을 포함한 isotonic buffer입니다.
8. 프로토콜보다 적은 양의 Cell을 사용할 때 Dye의 양을 조절해야 하나요?
AnnexinV와 EthDIII의 농도는 세포 수에 상관없이 일정하게 유지되면 됩니다. 그러나 staining의 최적화를 위해 필요에 따라서 농도를 증가/감소 시킬 수 있습니다.
9. 보관시 주의사항이 있나요?
Kit는 4°C에 보관하시고, 얼지않도록 주의해 주세요. AnnexinV와 EthDIII는 빛이 차단된 곳에서 보관해야 합니다.
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