ELISpot 과 FluoroSpot Kit
1. 해부/입체현미경을 사용하여 ELISpot 결과를 분석할 수 있나요?
ELISpot 신호를 읽는 가장 쉬운 방법은 ELISpot reader를 이용하는 것이지만 reader를 사용할 수 없는 경우 도립현미경을 사용할 수 있습니다. 일반적으로 개별 well 사진을 찍을 수 있는 해부/입체현미경으로 충분합니다.
2. 부착 세포를 ELISpot kit 및 ELISpot Development Module에 사용할 수 있나요?
부착 세포는 항원의 검출을 차단하지 않으므로 사용할 수 있습니다. 해당 세포에 맞는 희석액의 준비가 권장되며 세포를 너무 많이 사용하면 spot이 서로 겹쳐 결과가 부정확해질 수 있습니다.
3. Dual ELISpot 및 FluoroSpot kit는 개발 후 나중에 분석할 수 있도록 보관이 가능한가요?
해당 질문에 대한 제조사의 공식 연구 결과는 없으나 여러 사례에 기반하여 다음과 같은 제안이 가능합니다.
Dual-Color ELISpot kit를 사용하면 두가지 colorimetric substrate (BCIP/NBT 및 AEC)을 통해 두가지 사이토카인을 통시에 측정할 수 있습니다. BCIP/NBT는 매우 안정적이지만 AEC는 시간이 지남에 따라 희미해지기 때문에 Dual-Color ELISpot plate의 장기간 보관은 권장되지 않지만 최소 일주일 동안 4℃에서 보관할 수 있으며 빛으로부터 보호되는 경우 최대 한달까지 보관할 수 있습니다. Development 후에는 plate가 빛으로부터 보호되는 경우 4℃에서 최대 1주일동안 보관이 가능합니다.
4. ELISpot plate의 일부를 사용하고 나머지는 나중에 분석할 수 있도록 보관이 가능한가요?
Plate를 부분적으로 사용하지 않는것을 권장합니다. 하나의 ELISpot 분석을 위해 well을 비워둔 다음 ELISpot 분석에 사용하는 경우 무균이 문제가 될 수 있습니다.
5. ELISpot 분석은 ELISA 분석과 어떻게 다른가요?
두 분석 모두 포획 및 검출 항체를 활용하는 샌드위치 ELSIA 형식을 사용합니다. 전통적인 ELSIA는 혈청, 혈장, 조절배지와 같은 생물학적 샘플에서 분석물의 농도를 측정하고 설계되었습니다. 대조적으로, ELISpot 분석은 특정 분석물을 분비하는 세포의 상대적인 수에 대한 정보를 제공합니다. ELISPot 분석에서 세포는 plate에 추가되고 세포 바로 근처에 있는 고정화된 포확 항체가 관심있는 분비 단백질에 결합합니다. 사이토카인이 분비되는 부분은 well 바닥이 spot으로 사각화됩니다.
6. ELISpot kit 및 ELISpot Development Module에 몇 개의 세포를 사용해야 하나요?
최적의 결과를 얻는데 필요한 세포 수는 여러 변수에 의해 달라집니다. 고려해야할 변수는 세포 크기, 세포 유형, 분비 세포 수 및 자극 방법입니다. 이러한 여러 변수를 고려하여 well 당 10,000,000에서 10,000개까지 세포 희석을 권장합니다.
7. ELISpot kit의 하나의 plate에는 몇 개의 샘플을 테스트할 수 있나요?
Plate는 96 well로, 양성, 음성, 배경 및 검출 대조군을 위해 8개의 well이 필요합니다. 이를 제외하면 88개의 well이 남으며 44개의 샘플을 duplicate로 테스트하기 충분합니다.
8. ELISpot 데이터는 어떻게 수집해야 하나요?
발색 또는 형광 spot은 해부 현미경을 사용하여 수동으로 정량화하거나 ELISpot reader를 이용해 자동으로 정량화할 수 있습니다.
9. 동일한 표적 사이토카인에 대해 FluoroSpot kit와 Dual-Color ELISpot kit를 사용하는 것이 어떤 이점이 있나요?
같은 표적이라면 Dual-Color ELISpot와 FluoroSopt kit의 감도는 대체로 유사합니다. 다만 FluoroSpot kit는 동일한 세포가 분비하는 두가지 서로 다른 사이토카인의 co-localization을 더 정말하게 파악할 수 있습니다.
10. 세포를 별도의 plate에서 자극해야하나요, 아니면 ELISpot plate에서 직접 자극해야하나요?
세포 자극은 ELISpot plate 내에서 수행되어야 합니다.
11. ELISpot plate의 높은 background를 줄이거나 제거하기위한 권장사항은 무엇인가요?
세포를 plate에 분주하기 전에 튜브에서 배양 및 자극했다면 ELISpot plate에 넣기 전에 배양배지로 세포를 세척히야 합니다. 세척하지 않으면 배양배지로 분비된 사이토카인이 특이적 포획항체에 결합해 높은 배경신호가 발생할 수 있습니다.
12. ELISpot 분석에 권장되는 대조군은 무엇인가요?
양성 대조군의 경우 테스트 중인 분석물의 재조합 단백질을 사용하는 것이 좋습니다. 음성 대조군의 경우 자극된 세포와 동일한 수의 자극되지 않는 세포를 사용하는 것이 좋으며 멸균 배양 배지를 배경 대조군으로 사용하시기 바랍니다. 검출 항체 대조군의 경우 검출 항체 대신 PBS로 대체하는 것이 좋습니다.
13. ELISpot 분석이란 무엇인가요?
ELISpot은 Enzyme Linked Immunospot Assay의 약자입니다. 관심 단백질에 특이적인 포획 항체를 membrane에 코팅하고 세포를 추가합니다. 배양 기간동안 개별 세포에서 분비된 단백질은 단백질의 다른 epitope에 특이적인 biotinylated antibody를 사용하여 포획되고 검출됩니다. SA-AP 접합체에 이어 발색원 BCIP/NBT를 사용하면 항원 분비 세포 부위의 막에 비색 반점이 생성됩니다. 항원 분비 세포의 수는 ELISpot plate reader를 사용하거나 현미경을 사용하여 수동으로 정량화할 수 있습니다.
14. ELISpot kit와 ELISpot Development Module의 차이점은 무엇인가요?
ELISpot kit는 즉시 분석에 활용할 수 있으며 개발 및 개선이 필요하지 않습니다.
- ELISpot kit 구성 요소: Antibody-coated PVDF-backed 96-well Microplate, Detection Antibody, Streptavidin-AP, BCIP/NBT, Positive Control, Dilution Buffers, Wash Buffer
ELISpot Development Module과 ELISpot Blue Color Mudule은 각각 분석물 검출과 시각화에 필요한 구성요소가 포함되어 있습니다. 이러한 모듈은 함께 사용할 수 있지만 별도로 판매됩니다. 각 모듈에는 최소 5개의 96 well plate에 사용 가능한 충분한 양의 reagent가 포함되어 있습니다. 추가 공급품이 필요하며 분석 개발 전문 지식이 권장됩니다.
- ELISpot Development Module 구성요소: Capture Antibody Concentrate, Detection Antibody Concentrate
ELISpot Blue Color Mudule: Streptavidin-AP, BCIP/NBT
15. Dual-Color ELISpot kit와 Dual-Color Fluorospot kit의 차이점은 무엇인가요?
Fluorospot kit는 두 개의 NorthernLights™ 형광 프로브를 사용하여 별개의 세포 집단을 검출하는 형광 기반 분석인 반면, Elispot 키트는 NBT/BCIP와 함께 Streptavidin을 사용하고 검출을 위해 AEC와 함께 horseradish peroxidase를 사용하는 비색 기반 분석입니다.
16. 양성 대조군 spot이 어두운 이유는 무엇인가요?
양성 대조군은 재조합 단백질이며 양성 대조군을 포함하는 well이 어두운 것은 정상입니다. 이는 kit가 예상대로 작동하고 있음을 나타냅니다.
ELISpot Development Module
1. Antibody-coated ELISpot plate를 보관할 수 있나요 ?
네, 적절한 조건에서 보관 가능합니다. 프로토콜에 설명된 대로 plate는 blocking 후 blocking solution을 제거합니다. Plate를 30°C 진공 오븐에서 1시간동안 incubation 하고, 실리카겔 등의 제습제와 함께 지퍼백에 넣어 4°C에서 일주일동안 보관할 수 있습니다. 보관했던 plate는 각 well을 멸균 배양배지로 가득 채워 약 20분간 컨디셔닝하고 배지를 제거한 후 실험에 사용합니다.
- 진공 오븐이 없을 때: Plate를 blocking하고 blocking solution을 제거한 뒤 각 well에 적절한 용량의 PBS를 넣어 sealing 하여 4°C에서 최대 2일 보관합니다. 실험에 사용하기 전에는 위와 동일한 과정으로 well 컨디셔닝 후 사용합니다.
2. PVDF-bottom immunospot plate는 활성화를 위해 에탄올로 미리 적셔야 하나요?
plate membrane을 에탄올로 미리 적시면 sopt 수가 일정하지 않을 수 있으므로 권장하지 않습니다.
3. 검출항체를 2-8°C에서 overnight으로 배양하는 경우 권장되는 특정 시간 범위가 있나요?
검출 항체를 2-8°C에서 약 16-18시간 동안 overnight 배양합니다.
4. ELISpot plate의 높은 background를 줄이거나 제거하기 위한 권장사항은 무엇인가요?
세포를 plate에 분주하기 전에 튜브에서 배양 및 자극했다면 ELISpot plate에 넣기 전에 배양배지로 세포를 세척히야 합니다. 세척하지 않으면 배양배지로 분비된 사이토카인이 특이적 포획항체에 결합해 높은 배경신호가 발생할 수 있습니다.
그 밖의 방법으로는 Journal of Immunological Methods 257 (2001)에 보고된 aluminum foil method를 이용하는 것입니다.
5. ELISA 및 ELISpot 개발 시스템에 권장되는 BSA등급은 무엇인가요?
BSA 등급은 성공적인 ELISA를 실행하는데 중요한 구성 요소입니다. 최소 순도가 98%인 BSA를 권장합니다.
6. ELISpot plate하단에 고리 모양이 관찰되는 이유는 무엇인가요?
Membrane이 underdrain에 닿는 곳이기 때문에 관찰됩니다. 이를 방지하기 위해서는 I) 세포가 따뜻한 곳에 정착하는 것을 좋아하기 때문에 membrane 전체에 열을 분산 시키기 위해 plate 바닥에 알루미늄 호일을 사용합니다. II) Chromagen substrate 제거 후 plate를 헹굴 때에는 반드시 underdrain을 제거하고 양면을 깨끗이 헹구십시오. III) 분석 전에 membrane을 완전히 건조합니다.
* 제품에 대한 상세 내용은 아래 추천 제품을 클릭해 주세요.