[R&D Systems] Complete ELISpot Kits | 고마바이오텍

특징

ELISpot은 ELISA(효소결합 면역흡착 분석) 기술을 기반으로 하는 민감한 면역세포 분석법입니다. 특히, 사이토카인(cytokine) 등 특정 단백질을 분비하는 개별 세포를 시각적으로 검출하고 계수하는 데 사용됩니다. 

• 1가지 분석물질(analyte)만을 검출 및 계수할 수 있도록 설계된 마이크로플레이트 기반 면역 분석법입니다. 
• 높은 민감도로 100,000개 세포당 1개 이하의 분비 세포도 검출 가능합니다.
• 완제품 형식의 ELISpot 키트로, 시판 직후 바로 사용 가능하며 별도의 개발이나 최적화가 필요 없습니다.
• 세포 전처리 확장 없이 직접 사용 가능하며, 소량의 세포로도 고처리량 분석이 가능합니다.
• 개별 세포가 분비한 사이토카인은 capture antibody에 결합되고, 효소 반응을 통해 색소 침전물(spot)으로 시각화됩니다. 각각의 spot은 분비 세포 1개에 해당합니다.

Kit 구성품

• PVDF-backed 96-well Microplate
• Detection Antibody
• Streptavidin-AP
• BCIP/NBT
• Positive Control
• Dilution Buffers
• Wash Buffer

원리 및 실험 방법 

1. 항체 코팅된 마이크로플레이트 준비 

• PVDF 멤브레인이 부착된 96-well 마이크로플레이트에 monoclonal 또는 polyclonal 항체가 고정되어 있습니다.
• 이 항체는 분석하려는 물질(예: IFN-γ, IL-2 등)에 특이적으로 결합합니다. 

2. 세포 접종 및 자극 

• 실험에 적절히 자극된(antigen 등으로 활성화된) 면역세포를 각 well에 넣습니다.
• 플레이트는 37°C, CO₂ 가습 배양기에서 일정 시간 동안 배양됩니다.
• 이 기간 동안 세포는 사이토카인을 분비하고, 분비된 물질은 바로 근처의 고정된 항체에 결합합니다. 

3. 세포 및 비특이물질 제거 

• 세포와 결합하지 않은 물질들을 세척(washing) 단계에서 제거합니다. 

4. 검출 항체 처리 

• 분석물질에 특이적인 biotin-conjugated polyclonal 항체를 추가합니다.
• 이 항체는 이미 고정된 항체에 의해 포획된 분석물질에 다시 결합합니다 (샌드위치 구조 형성).
• 이후 남은 biotin 항체는 세척으로 제거합니다. 

5. 효소 결합 및 색 반응 

• Streptavidin-AP 효소가 붙은 streptavidin을 추가합니다.
• streptavidin은 biotin과 매우 강하게 결합합니다. 
• 다시 한 번 세척하여 비결합 효소를 제거합니다. 
• 이후 BCIP/NBT를 넣으면, 효소 반응을 통해 검은색-청색의 침전물이 생성되어 spot(점)으로 나타납니다.  

6. 결과 판독 

• 각 점은 하나의 분석물질을 분비한 개별 세포 1개를 의미합니다.
• 이 점들은 자동 ELISpot 판독기나 입체현미경(stereomicroscope)을 이용한 수동 계수를 통해 카운팅 됩니다. 

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