[FAQ] Purified EVs를 염색하는 방법을 안내합니다. (Exosome staining) | 고마바이오텍

▒ ExoBrite 형광으로 염색하는 방법

준비물 : 

• Sterile-filtered PBS

• ExoBrite™ CTB, WGA, or Annexin EV Staining Kits 

염색 방법 

1. -80°C에서 보관한 경우 EV를 해동합니다.
2. 제품 정보 시트에 따라 1X ExoBrite™ 염색 용액을 준비하여 샘플당 500 uL를 만듭니다.
3. 50 uL의 EV를 flow tube에 분주합니다. 각 염색에 대한 background control로, 항상 EV가 없는 대조 튜브(예: 멸균 여과 PBS 50 uL 포함)를 준비합니다.
4. 1X ExoBrite™ 염색 용액 450 uL를 EV 및 대조 튜브에 넣고 vortex합니다.
5. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

▒ Exosome marker 항체로 염색하는 방법

준비물 : 

• Sterile-filtered PBS

• Primary antibodies (i.e., ExoBrite™ CD9 Flow Antibody, ExoBrite™ CD63 Flow Antibody, or ExoBrite™ CD81 Flow Antibody)

• Isotype control antibodies (i.e., ExoBrite™ IgG1 Isotype Control Flow Antibody)

염색 방법 

1. EV가 -80°C에서 보관된 경우 해동합니다.
2. EV 100 uL를 flow tube에 분주하고 나머지 EV는 -80°C에서 보관합니다. 각 염색에 대한 background control로, 항상 EV가 없는 대조 튜브(예: 멸균 여과 PBS 100 uL 포함)를 준비합니다.
3. 각 튜브에 원하는 양의 표지된 항체를 넣고 vortexing하여 잘 섞습니다. 또한 동일한 dye로 표지된 isotype control 항체로 염색된 EV 튜브를 함께 준비하는 것이 좋습니다.
   참고: ExoBrite™ Flow Antibody의 경우 1-5 uL를 사용합니다. 다른 1차 항체의 경우 시작점으로 0.1 ug를 제안하지만 항체를 titration해야 할 수도 있습니다. ExoBrite™ Isotype control flow antibody는 ExoBrite™ Flow tetraspanin 항체와 함께 대조로 사용할 수 있습니다.
4. 어두운 곳에서 실온에서 30분간 배양합니다.
5. 유세포 분석을 실행하기 전에 900 uL PBS를 추가합니다.

▒ Bead-Bound EVs 염색 방법

1. 튜브를 자석에 1분간 올려놓고 피펫으로 상층액을 버립니다.
2. 튜브를 자석에서 제거하고 300 uL의 PBS를 첨가하여 비드 결합 EV를 세척하고 피펫으로 부드럽게 섞습니다.
3. 1-2단계를 한 번 반복합니다.
4. 튜브를 자석에 1분간 올려놓고 상층액을 버립니다.
5. ExoBrite™ 항체를 사용하는 경우 비드 결합 EV(및 EV 없는 대조 비드)를 100 uL의 PBS에 재부유시킵니다. 다른 염색의 경우 6단계로 진행합니다.
6. 원하는 EV 염색을 추가합니다. 비드 단독(EV 없음, 염색 없음), 비드 + 염색(예: EV 없음, 각 염색 또는 Ab)등의 대조 튜브를 설정하는 것이 좋습니다. 제품 페이지의 프로토콜을 사용하여 추가 지침을 얻을 수 있습니다.
   참고 1: 항체의 경우 1ug/mL이 좋은 시작점이지만 관심 항체를 titration 하는 것이 좋습니다.
   참고 2: 염색과 관련하여 친유성 막 염색제(예: PKH 또는 DiI)는 비드에 직접 달라붙기 때문에 권장하지 않습니다. ExoBrite™ CTB 또는 WGA EV 염색 키트를 권장합니다.
7. 어두운 곳에서 rocker에서 4°C에서 30분 동안 반응합니다.
8. 튜브를 자석에 1분 동안 올려놓고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
9. 튜브를 자석에서 제거하고 300uL의 PBS를 추가하여 비드 결합 EV를 세척하고 피펫으로 부드럽게 섞습니다.
10. 튜브를 자석에 1분간 올려놓고 피펫으로 상층액을 버립니다.
11.  비드를 500 uL의 PBS에 다시 현탁시키고 flow 튜브로 옮깁니다.
12.  유세포 분석기에서 느린 속도로 샘플을 실행하여 샘플당 최소 2,000개의 이벤트를 수집합니다.