1. Boyden Chamber를 이용한 실험을 해본 적이 없습니다. Cell Invasion kit를 이용할 때 24-well과 96-well 중 어느 것이 더 성공할 가능성이 높은가요?
Invasion 연구의 초기 단계이고 조건을 최적화하고 있다면 우선 24-well 포맷으로 시작하기를 추천합니다. 조건이 최적화되고 실험 절차에 익숙해진 후 96-well 포맷으로 확장하시면 됩니다.
2. 콜라겐이 막의 아랫부분에 코팅되어있는 #CBA-101-COL 제품과 콜라겐이 막의 윗부분에 코팅되어있는 #CBA 111-COL 제품의 차이가 무엇인가요?
각각 cell migration과 cell invasion을 위한 용도입니다. #CBA-101-COL은 hepatotaxis를 측정하기 위한 assay이며, 세포가 이동하는 chemoattractant로 작용하는 고정된 ECM 단백질을 이용합니다. #CBA 111-COL은 cell invasion을 측정하기 위한 assay이며 이는 세포 이동, ECM의 분해, proteolysis, 그리고 세포가 ECM을 통해 인접 조직으로 이동하는 복잡한 과정을 포함합니다. 이 assay에서는 세포가 MMPs와 같은 활성 단백질분해효소를 발현하여 막 상단의 코팅된 물질을 통과하고 소화할 수 있어야 합니다.
3. Cell Detachment Solution으로 incubation 할 때 챔버 윗부분에 남아있는 non-invasive cell이 막을 통과하여 챔버 아래쪽으로 가지 않는다는 것을 어떻게 보장할 수 있나요?
Boyden chamber assay에 사용되는 membrane pore 크기는 세포의 직경보다 작아서, 세포가 수동적으로 pore를 통과하지 못하도록 합니다. 세포가 membrane pore를 통과하려면, 선두자리 (leading edge)를 확장하고 actin/myosin cytoskeleton 구조를 재배열해야 합니다. 그러기 위해서는 충분한 시간이 필요하기 때문에, Cell Detachment Solution으로 인큐베이션하는 30분 동안에는 세포가 membrane pore를 통과하기 어렵습니다.
4. Colorimetric Invasion Assay는 96-well 포맷으로도 제공되나요?
Colorimetric cell invasion assay는 24-well plate로만 제공하고 있습니다.
5. 기저막과 콜라겐 중에 어떻게 선택할 수 있나요?
대부분의 cell invasion 연구에서는 insert에 기저막 코팅을 합니다. 콜라겐 젤이 코팅된 insert는 콜라겐에 의해 매개되는 invasion에 관한 연구에만 사용됩니다.
6. 위쪽에는 serum free media를 사용하고 아래쪽에는 10% serum을 사용하는 이유는 무엇인가요?
Serum은 많은 사이토카인과 성장인자를 포함하고 있기 때문에 cell migration과 invasion assay에서 종종 chemoattractant로 사용됩니다. 세포를 serum free media에 resuspending함으로써 챔버 위쪽과 챔버 아래쪽 10% serum 사이에 chemoattractant gradient가 형성되고, 이는 세포가 젤 층을 통해 들어갈 수 있도록 해줍니다.
7. Assay 시작 전에 세포를 serum free media에서 기르는 것이 필수인가요?
일부 연구자들은 serum에 많은 사이토카인과 성장인자가 포함되어 있기 때문에 세포를 굶기기도 합니다 (주로 암세포주). 굶긴 세포는 일반적으로 chemoattractant treatment에 잘 반응합니다. 오버나이트로 굶길 필요는 없습니다. 대신에 assay 시작 전에 세포를 serum free media에 resuspend해서 사용하면 됩니다.
8. ECM 구성요소는 무엇인가요?
기저막 invasion assay의 insert는 Matrigel과 똑같은 ECM gel로 코팅되어 있습니다. ECM 추출물은 mice로부터 생산된 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma로부터 준비되었습니다. 주요 성분으로 라미닌을 포함하고 있으며 collage type IV, heparan sulfate proteoglycan, entactin, 그리고 다른 미세 성분들을 포함하고 있습니다.
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