1. Proteus Ni Advance Spin Column Kit는 어떤 실험에 이용되나요?
신속한 one-step batch binding purification을 위해 디자인된 제품으로, prep용 정제와 오염물질 제거에 유용합니다. Spin column과 함께 loose resin이 제공되어 IMAC으로 poly-histidine tagged recombinant protein을 정제할 때 이용됩니다.
2. Fastback Ni Advance Resin의 보존 기간은 얼마나 되나요?
2-8°C에서 보관시 생산일로부터 2년간 보장됩니다.
3. Metal chelate 분리를 위한 샘플은 어떻게 준비해야 하나요?
모든 샘플을 최대 0.45 μm (가급적이면 0.20 μm) pore size로 필터링하는 것을 권장합니다. 보통 높은 점성은 DNA 또는 RNA 오염에 의해 일어납니다. 이러한 점성은 주사기 바늘에 몇 차례 통과해주거나, 적절한 양의 DNase and/or RNase (5-10 μg/ml) 을 용해 버퍼에 추가하고 이 혼합물을 얼음 위에서 15분 동안 배양함으로써 줄일 수 있습니다.
4. Lysis buffer에 β-mercaptoethanol(또는 DTT)를 추가해야 하나요?
IMAC chromatography를 위해 Fastback Ni Advance resin에 사용할 수 있는 환원제는 DTT와 EDTA이며, 양은 최대 20 mM DTT, 20 mM EDTA 입니다.
5. Metal chelate resin을 다시 사용할 수 있나요?
Elution buffer로 resin을 세척하고 binding buffer로 resin을 다시 equilibrate하는 것을 권장합니다. resin을 바로 다시 사용해야 한다면, pre-equilibrium 단계를 진행합니다. 재생성 후, resin은 다음에 사용할 때까지 2-8°C에서 증류수에서 만든 0.1 % sodium azide를 포함하는 screw-capped bottle에 보관합니다.
6. 최종 용출액에 이물질의 수준을 낮게 유지하려면 어떻게 해야 하나요?
Binding buffer는 최소 10 mM imidazole, Wash buffer는 최소 20-30 mM imidazole을 포함하도록 권장합니다.
7. Chromatography 단계에서 resin의 일부가 건조되었다면 문제가 있나요?
Resin은 견고하기 때문에 일부 건조되었다면 빠르게 rehydrate됩니다. 따라서, resin의 성능에 악영향을 미치지 않습니다.
8. 최종 용출 단계 이후 imidazole을 제거해야 하나요?
단백질을 보관할 예정이면, imidazole을 꼭 제거해야 합니다. 그렇지 않으면, -20°C 또는 -80°C에서 단백질이 침전될 수 있습니다.
9. 정제된 단백질을 바로 SDS-gel에 로딩할 수 있나요?
기본 조건에서 정제된 단백질은 SDS-gel에 바로 로딩할 수 있습니다. 6-8 M urea의 denaturing condition에서 정제된 단백질 또한 denaturing SDS-polyacrylamide gel에 바로 로딩할 수 있습니다. 하지만, 4-6 M guanidine hydrochloride에서 정제된 단백질은 SDS gel에 로딩하기 전에 ultrafiltration device를 이용하여 denaturant를 포함하지 않는 버퍼로 교체해야 합니다.
10. 정제 후 재조합 단백질에서 His-tag을 제거해야 하나요?
대부분의 용도를 위해서는, terminal His-tag을 제거하지 않아도 됩니다. 하지만, 활성, 안정성, 또는 구조 결정에 영향을 줄 수 있습니다.
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