[FAQ] Flow Cytometry Troubleshooting | 고마바이오텍

1. 시그널이 너무 낮거나 시그널이 없습니다. 

시그널이 너무 낮거나 없는 이유는 크게 세가지 원인이 있습니다. 

(1) 1차 항체 농도의 문제

(2) 세포 수집 방법의 문제

(3) 유세포 분석기의 성능 문제 

• 2차 항체가 1차 항체를 인식하는지 확인하세요. 
• 기존에 2차 항체로 좋은 결과를 얻었다면, 1차 항체의 양을 줄이고 incubation time을 (4도에서 최대 2시간까지) 늘여보세요.
• 1차 항체의 농도가 너무 낮을 경우 이런 현상이 있을 수 있습니다. 1차 항체를 더 사용하거나 serial dilution을 통해 최적의 농도를 찾으세요.
• 세포내 단백질을 염색할 경우에는 세포를 투과화 해야 합니다.
• 세포 표면 단백질을 감지하려 한다면, 그 단백질이 internalized되었을 수 있습니다. 트립신은 세포 표면 단백질의 internalization을 유도하기 때문에 세포 분리 방법을 변경해야 할 수 있습니다. NaN₃를 추가하여 세포 표면 단백질의 internalization을 줄이거나 reagent를 얼음에 보관하는 것도 도움이 됩니다.

2. 백그라운드가 너무 높습니다.

1차 항체의 농도가 너무 높거나 blocking이 충분하지 않을 때 백그라운드가 높게 나올 수 있습니다.

• Direct Flow cytometry 방법을 사용한다면, 적절한 conjugated IgG isotype 대조군을 사용하세요.
• Indirect Flow cytometry 방법을 사용한다면, 음성대조군으로 2차항체만을 사용하세요. 
• 항체가 너무 많으면 백그라운드가 크게 생깁니다. 최적의 농도를 정하기 위해 항체를 다양한 농도로 희석해보세요.
• 항체가 Fc receptor 등 off-target binding을 할 수 있습니다. Off-target binding을 최소화할 수 있게 Fc receptor blocking reagent를 이용하세요.
• 시료 내 분열중인 세포로 인한 doublet이 있을 수 있습니다. EDTA를 버퍼에 넣거나 30 um 필터를 이용하여 세포를 필터링 해보세요. 
• 유세포분석기를 조정해야 할 수 있습니다. offset이 너무 낮거나 gain이 너무 높으면 백그라운드가 생길 수 있습니다.
• conjugated된 1차 항체를 사용하지 않는다면, 단순히 washing 횟수를 늘이거나 프로토콜에 washing하는 단계를 추가해보세요.
• 다중 fluorochrome을 이용하면 spillover가 생길 수 있습니다. 

3. Event rate가 적절하지 않습니다.

유세포분석기가 개별 세포를 일관되게 구별할 수 없는 경우 event rate가 비정상적으로 나타납니다. 유의한 감지를 위해서는 10^7 정도의 이벤트를 얻어야 합니다.

• Event rate가 너무 낮으면 세포가 적절하게 혼합되었는지, 세포 집단이 1 x 10^5 ~ 1 x 10^6 cells/ml 범위에 속하는지 확인해 보세요.
• Event rate가 너무 낮으면 세포가 서로 뭉치는 것일 수도 있습니다. Debris를 제거하기 전에 세포를 제대로 sieve하였는지 확인해보세요.
  

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