1. CometSlides™에서 agarose가 떨어지는 것을 막으려면 어떻게 해야 하나요?
FLARE™와 CometSlides™는 알칼리 처리 중 agarose의 결합을 향상시키기 위해 특별히 처리되어 있습니다.
권장 사항:
- agarose와 세포 혼합물을 슬라이드 웰 전체에 고르게 펴 바르는 데 특별히 주의해야 하며, 슬라이드의 색이 있는 부분에 agarose가 묻지 않도록 조심해야 합니다.
- 슬라이드는 항상 용액에 넣어야 하며, comet slide 위에 buffer를 붓거나 따라내서는 안 됩니다.
- 슬라이드가 알칼리 완충액에 머무는 시간을 최소화하고, 권장된 인큐베이션 시간을 따라야 합니다.
- 세포를 LMAgarose와 혼합하기 전에 PBS로 세척하여 배지를 제거해야 합니다.
- 세포와 용융 agarose의 비율을 1:10 이상으로 늘리지 않아야 합니다.
- lysis 전에 슬라이드를 4°C에서 15분간 두어 agarose가 완전히 굳도록 해야 합니다.
2. 소변에서 분리한 세포로 분석이 가능한가요?
가능하지만 충분한 세포 수 확보와 적절한 전처리가 필수입니다.
3. Alkaline Control Cells를 Neutral Assay에도 쓸 수 있나요?
아니요. 각각 고유 방식에 맞는 control cells를 사용해야 합니다.
4. CometChip은 염색 전에 보관이 가능한가요?
네. 중화된 상태로 4°C, pH 7.4 Tris buffer에 며칠간 보관할 수 있습니다.
5. Whole blood는 사용 가능한가요?
추천되지 않습니다. 혈구는 핵이 없고, 헤모글로빈이 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
6. Control Cells 보관 방법은?
CometAssay Control Cells는 액체질소에서 보관해야 합니다. 동결과 해동을 반복하면서 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해, CometAssay Control Cells는 작업용 소분으로 나누어 해동 및 동결해야 합니다. 구체적인 지침은 CometAssay Control Cells 설명서를 참고하시기 바랍니다.
7. 커버슬립 없이 사용 가능한가요?
네. 커버슬립 없이 사용하도록 설계되어 있으며 제거 시 agarose가 손상될 수 있습니다.
8. Anti-fade 용액과 SYBR® Gold를 섞어도 되나요?
가능하지만, 직전에 혼합하여 사용하는 것이 좋습니다.
9. 슬라이드를 일부만 사용 후 재사용 가능한가요?
불가능합니다. 코팅 손상으로 인해 재사용이 불가합니다.
10. CometChip® 재사용 가능한가요?
불가능합니다. 한 번 사용 후 폐기해야 합니다.
11. CometChip에서 셀 처리 시간을 늘려도 되나요?
권장하지 않습니다. 필요한 경우 별도 처리 후 옮겨야 합니다.
12. 분석 소프트웨어는 21CFR 인증 받았나요?
아니요. 해당 소프트웨어는 인증받지 않았습니다.
13. 실험을 중단하고 다음 날 이어서 할 수 있나요?
CometAssay® 실험에서 lysis(세포 용해) 단계는 4℃에서 30분에서 60분 정도 수행하거나, 하룻밤 동안 진행할 수도 있습니다. 이 과정을 제외한 나머지 실험 절차는, 염색(staining) 단계를 제외하고, 슬라이드에 올려진 샘플이 완전히 건조될 때까지 모두 마쳐야 합니다. 슬라이드가 완전히 건조된 후에는, 제습제를 넣은 상태로 실온에서 보관이 가능하며, 이후 DNA 손상 정도를 분석하는 scoring 단계에서 사용할 수 있습니다.
14. 20well 슬라이드 염색량은?
well당 50 µL 사용을 권장합니다.
15. 슬라이드 크기는?
2/3-well: 75×25 mm
20-well: 75×50 mm
96-well: 122×78 mm
16. 이미지에 artifact가 생기는 이유는 무엇인가요?
젤이 마르지 않았거나 debris, agarose 품질 문제가 원인일 수 있습니다.
17. Control Cells는 어떤 세포주인가요?
불멸화된 인간 림프구 세포주입니다.
18. Control Cells는 어떤 약물로 처리했나요?
Alkaline: Etoposide
Neutral: Bleomycin
19. 이미지 분석용 소프트웨어는 어떤 것이 있나요?
CometAssay Analysis Software가 자동 분석 및 정량화 기능을 지원합니다.
20. CometSlide™ vs CometChip® 차이점은 무엇인가요?
CometSlide: 수동 도포
CometChip: micropore 기반 고처리량 분석용
21. 전기영동 버퍼의 pH가 중요한 이유는 무엇인가요?
전기영동 완충액의 pH는 어떤 종류의 DNA 손상을 분석할 수 있는지를 결정합니다. pH 12.1에서는 DNA의 초기 절단만을 분석할 수 있으며, pH 12.5와 pH 13에서는 염기성 환경에서 불안정한 결합(adducts)이 절단으로 전환됩니다. pH 12.5에서는 기본적인 DNA 손상이 단일 가닥 절단으로, pH 13에서는 추가적인 불안정 부위들이 단일 가닥 절단뿐만 아니라 이중 가닥 절단으로도 바뀝니다. 따라서 FLARE™ Assay, CometAssay®, CometChip® Kit를 사용할 때는 pH 13 조건에서 실험하는 것이 손상 물질에 의해 발생한 최대 수준의 DNA 손상을 가장 효과적으로 시각화할 수 있습니다.
22. SYBR® GOLD용 필터는 어떤 것 적합한가요?
fluorescein 필터 (excitation 496 nm / emission 522 nm)가 적합합니다.
23. Control Cells의 목적은 무엇인가요?
실험 간 표준화 및 비교를 위한 용도로 사용됩니다.
24. CometChip 포어 크기는 몇인가요?
지름 30 µm, 깊이 50 µm 입니다.
25. SYBR 외에 다른 염색제는 어떤것이 있나요?
Acridine Orange, EtBr, DAPI, PI, Hoechst, YoYo‑1 등이 가능하나 테스트 여부 확인이 필요합니다.
26. Positive Control에서 comet tail이 작거나 안 보이는 이유는 무엇인가요?
세포 용해, 알칼리 변성, 전기영동이 제대로 이루어지지 않으면 결과가 좋지 않을 수 있습니다. 용해 용액은 실온에 장기 보관하고 사용 전 4°C로 냉각해야 하며, 4°C에 오래 보관하면 침전이 생깁니다. 용해는 4°C에서 하룻밤 진행하는 것이 좋습니다. 알칼리 변성은 실온에서 20분, 또는 4°C에서 최소 1시간 해야 하며, 알칼리 용액은 신선하게 준비해야 합니다. 전기영동 조건도 중요하며, 일반 전기영동 장비보다 전용 CometAssay 장비를 사용하는 것이 좋습니다. 전기영동 시간이 부족하면 4°C에서 최대 1시간까지 늘릴 수 있습니다.
27. Healthy Control에 tail이 보이는 이유는 무엇인가요?
CometAssay Control Cells는 세포 주기의 모든 단계에 있는 비동기화된 세포 집단에서 준비되었습니다. 이 중 일부 세포는 DNA 복제 중일 수 있으며, 복제 포크에서 가닥 절단이 발생할 수 있습니다. 부적절한 보관은 DNA 손상을 일으킬 수 있으므로, CometAssay Control Cells를 -80°C에 보관하지 말고, 액체질소에 소분하여 보관해야 합니다.
28. 원심 후 펠릿이 보이지 않는 이유는 무엇인가요?
세포 수가 너무 적을 수 있습니다.
29. CometChip 처리 시 누수 발생 원인은 무엇인가요?
첫째, 처리 시간이 너무 길 경우입니다. macroformer는 약 30분의 로딩 시간과 약 1시간의 처리 시간을 기준으로 설계되었으며, 처리 시간이 길어지면 누수가 발생할 수 있습니다. 만약 더 긴 처리가 필요하다면, 조직 배양 플레이트에서 처리한 후 세포를 CometChip으로 옮기는 것이 좋습니다.
둘째, 슬라이드가 macroformer에 제대로 위치하지 않은 경우입니다. 슬라이드가 검은색 바닥에 정확히 놓이지 않으면, macroformer가 제대로 고정되어 밀폐되지 않아 누수가 생깁니다. macroformer가 검은색 바닥 위에 고르게 위치했는지 확인해야 하며, 장치를 항상 검은색 바닥 부분을 잡고 들어야 합니다. 흰색 macroformer 부분을 잡으면 자석이 분리되어 누수가 발생할 수 있습니다.
셋째, CometChip의 유효 기간이 지난 경우입니다. CometChip은 8주간 사용할 수 있으며, 유효 기간이 지난 제품은 건조되어 macroformer와 제대로 밀폐되지 않아 누수가 발생할 수 있습니다.
30. Control Cells 세척에 PBS를 쓰는 이유는 무엇인가요?
배지 성분이 agarose 부착을 방해할 수 있기 때문입니다.
31. ZEISS 현미경으로 관찰 가능한가요?
가능합니다.
32. 일반 전기영동 장비로 실험 가능한가요?
가능하지만 조건이 다르므로 권장되지 않으며, 일관성을 위해 전용 시스템 사용이 좋습니다.
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