1. 표적 유전자 제거(Knock-out)를 위해 몇 개의 sgRNA가 필요한가요?
정확한 유전자 제거와 실험의 신뢰성을 위해 최소 3개의 crRNA(또는 sgRNA) 서열 사용을 권장합니다. 서로 다른 서열로 얻은 여러 유전체 변이체들은 혹시 모를 오프 타겟(Off-target, 비표적 절단) 효과에 대비한 안전장치가 되어줍니다.
2. 기존 플라스미드나 바이러스 방식보다 '합성 sgRNA(RNP)' 방식이 좋은 이유는 무엇인가요?
세포 내에서 직접 발현시킬 필요 없이 완성된 복합체(RNP) 형태로 전달하므로 다음과 같은 압도적인 장점이 있습니다.
- 빠른 제작: 화학적 합성을 통해 영업일 기준 3일이면 완성됩니다. (플라스미드 방식은 1주일 이상 소요)
- DNA-free: 외래 DNA를 넣지 않으므로, 원치 않는 유전자 삽입(Transgene integration) 위험이 없습니다.
- 즉각적인 효과: 세포 내 전사 과정이 필요 없어 도입 즉시 유전자 편집이 시작됩니다.
- 낮은 부작용: 세포 내에서 일시적으로 작용하고 빠르게 분해되므로 오프 타겟 효과가 적습니다.
- 낮은 면역원성: 바이러스 방식에 비해 세포 독성과 면역 반응이 현저히 낮아 인비보(in vivo, 체내) 실험에 이상적입니다.
3. 단일 sgRNA를 쓰는 것이 crRNA:tracrRNA 두 가닥(Duplex)을 쓰는 것보다 나은가요?
네, 더 유리합니다. sgRNA는 별도의 어닐링(결합) 과정이 필요 없어 편리할 뿐만 아니라, 여러 연구에 따르면 Cas9과 결합했을 때 두 가닥 방식보다 안정성이 높아 편집 효율이 더 뛰어난 것으로 밝혀졌습니다.
4. 화학 합성 sgRNA가 IVT(시험관 내 전사) 방식보다 왜 좋은가요?
전통적인 IVT 방식의 sgRNA는 끝부분에 5’-triphosphate를 가집니다. 이는 세포 내에서 선천 면역 반응을 유발하고 독성을 일으킬 수 있습니다. 반면, 화학적으로 합성된 sgRNA는 이러한 독성 없이 훨씬 높은 편집 효율을 보여줍니다.
5. '수정된(Modified) sgRNA'를 선택해야 하는 이유는 무엇인가요?
GenScript의 수정된 sgRNA는 양 끝부분에 2’-O-methyl 및 Phosphorothioate(PS) 처리가 되어 있습니다.
2’-O-methyl은 가수분해와 핵산 분해 효소로부터 RNA를 보호하고, PS는 핵산 분해 효소에 대한 저항성을 높여 세포 내에서 sgRNA가 더 오래 살아남게 합니다.
6. 제작 가능한 최대 길이는 얼마이며, 어떤 형태로 배송되나요?
길이는 최대 266nt까지 화학적으로 합성할 수 있습니다. 싱글 튜브 또는 96웰 플레이트 형태로 제공됩니다. 건조 분말(Powder) 상태나 TE 버퍼 또는 멸균수에 녹인 상태 중 선택 가능합니다.
7. 서비스 등급(Grade)은 어떻게 나뉘나요?
연구 단계에 따라 두 가지 주요 옵션을 제공하며, cGMP 등급도 지원합니다.
- EasyEdit sgRNA: 최적화된 탈염(Desalt) 정제 방식. 가격이 저렴하고 배송이 빨라 스크리닝이나 초기 연구에 적합합니다.
- SafeEdit sgRNA: HPLC 정제를 통해 90% 이상의 순도를 보장합니다. 결과값의 검증(Validation) 단계에 권장합니다.
- cGMP sgRNA: 임상 및 상용화 단계용으로 별도 제공됩니다.
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