1. 샘플 내 활성 small GTPase의 수준이 낮을 때에도 Small GTPase
Activation Assay로 감지할 수 있을 지 염려됩니다. 좋은 결과를 얻기 위한 팁을 알려주세요.
Small GTPase Activation Assays를 사용하여 결과를 향상시킬 수 있는 두가지 요소가 있습니다.
1.
Pull-down을 하기 전 먼저 타겟을 검출할 수 있는지 확인하는 것이 좋습니다. pull down을 하지 않고, 키트에 제공된 항체를 사용하여 먼저 Western Blot을 수행하여 확인합니다.
2.
Pull-down을 할 때, 가능한 한 많은 lysate 사용하세요. 활성 형태는 일반적으로 전체에서 매우 적은
비율을 차지하기 때문에 언급한 Western Blot에서 확실한 밴드를 얻기 위해서는 필요한 lysate의 100배를 사용하는 것을 권장합니다.
2. 활성형 Active Ras family member의 역할을 연구하고 있습니다. 활성형태를
감지하기 위해 Small GTPase Activation Assays 대신 일반적인 Western Blot을 사용해도 괜찮을까요?
아니요. 활성형 small GTPase의 검출을 위해 Western Blot에만 의존하는 것은 권장하지 않습니다. 활성형 GTP에만 결합하고 비활성형 GTP에는 결합하지 않는 항체를 찾기 어렵기 때문입니다.
3. Small GTPase Assay Beads (Raf-RBD, PAK1-PBD,
Rhotekin-RBD)는 종 특이적인가요?
특정 small GTPase의 시퀀스는 다양한 species 간에 최대 1개 또는 2개의 아미노산 변이만 있기 때문에, Bead와 항체는
다수의 species 샘플에 사용할 수 있습니다.
4. 조직 lysate 샘플에 사용할 수 있을까요?
네. Small GTPase Activation
Assays는 조직 lysate 샘플에 사용할 수 있습니다. 조직 샘플은 proteinase inhibitor를 포함하는 1X Assay/Lysis buffer나 다른 lysis buffer에서 20-50mg/ml로 resuspension 할수 있습니다. 균질화한 후, 스핀을 하고 상층액을 이용합니다.
5. 다른 lysis buffer를 사용해도 괜찮을까요?
네. RIPA buffer 같은 다른 lysis buffer를 사용해도 괜찮습니다. 5X Assay/Lysis buffer를 아래와 같이 제조하여 이용하세요.
5X Assay/Lysis buffer: 125mM HEPES, pH 7.5, 750mM NaCl, 5% NP-40, 50mM MgCl2,
5mM EDTA, 10% Glycerol.
6. 대조군은 각 샘플마다 돌려야 하나요
아니면 assay마다 한번만 돌려도 되나요?
GDP와 GTPgS loading control은
pull down이 제대로 되는지 확인하기 위해 사용하는 assay용
대조군입니다. Control은 시료내의 내인성 small GTPase 활성과 독립적이므로, 한번만 확인하면 됩니다.
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