적혈구 용해버퍼 | Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer | 고마바이오텍

• 혈액에서 백혈구(WBC)를 분리하기 위해 적혈구를 신속하게 용해시키는 시약입니다.
• 적혈구만 선택적으로 파괴하며, 백혈구는 손상 없이 온전하게(Intact) 보존합니다.
• 분리된 백혈구는 DNA, RNA, 단백질 추출 등 다양한 후속 실험에 바로 사용할 수 있습니다.
• 백혈구 세포층(Buffy coat)을 1차 분리한 후, 남아있는 잔여 적혈구를 깨끗하게 제거할 때도 유용합니다.
• 세포의 생존율(Viability)에 영향을 주지 않으므로, 분리한 백혈구를 세포 배양(Cell culture) 목적으로도 그대로 사용할 수 있습니다.
• 혈액 샘플 0.3 ml 기준으로 총 1,000회 사용할 수 있는 분량입니다.

실험 과정

[방법 A] 전혈(Whole Blood)에서 백혈구 분리하기

가장 일반적인 0.3 ml 전혈 샘플을 사용하여 백혈구를 분리하는 방법입니다. 

1. 혼합 및 교반: 1.7 ml 마이크로 튜브에 전혈 0.3 ml와 적혈구 용해 버퍼 0.9 ml를 넣고, Vortexer로 20초간 강하게 섞어줍니다.
2. 반응(인큐베이션): 적혈구가 완전히 파괴되도록 실온에서 10분간 방치합니다.
3. 원심분리 1차: 4ºC 조건에서 3,000 × g로 3분간 원심분리한 후, 상층액은 버립니다. (바닥에 하얀색 세포 침전물(Pellets)이 남습니다.)
4. 세척: 하얀색 침전물에 차가운 PBS 1 ml를 넣고 피펫으로 세포를 잘 풀어준 뒤, 4ºC에서 3,000 × g로 3분간 다시 원심분리합니다.
5. [선택] 잔여 적혈구 제거 1: 만약 하얀색 침전물에 여전히 붉은 빛이 남아있다면, 적혈구 용해 버퍼 0.3 ml를 추가하고 피펫으로 풀어준 뒤 실온에서 5분간 방치합니다.
6. [선택] 잔여 적혈구 제거 2: 4ºC에서 3,000 × g로 3분간 원심분리하고 상층액을 버립니다.
7. 반복: 침전물에서 붉은 색이 완전히 사라질 때까지 5번과 6번 과정을 반복합니다.

[방법 B] 버피 코트(Buffy Coat)에서 적혈구 제거하기

많은 양의 혈액(10 ml)을 원심분리하여 백혈구 층(Buffy coat)만 먼저 걷어낸 뒤 적혈구를 제거하는 대체 프로토콜입니다. 

1. 원심분리: 헤파린 등 항응고제가 들어있는 10 ml 유리관에 혈액 10 ml를 채우고, 2,000 × g에서 10분간 원심분리합니다.
2. 버피코트 채취: 파스퇴르 피펫을 이용해 중간의 하얀색 버피 코트(Buffy coat) 층만 조심스럽게 흡입합니다. 이를 적혈구 용해 버퍼 4 ml가 들어있는 15 ml 튜브에 넣고 Vortexer로 가볍게 섞어줍니다.
3. 반응: 실온에서 10분간 방치합니다.
4. 원심분리 1차: 백혈구를 가라앉히기 위해 2,000 × g에서 5분간 원심분리하고 상층액은 버립니다.
5. 재현탁: 남은 액체를 완전히 제거한 후, 다시 적혈구 용해 버퍼 1 ml를 넣어 백혈구를 풀어줍니다.
6. 마이크로 튜브 이동: 세포 용액을 1.5 ml 마이크로 튜브로 옮긴 후 3,000 × g에서 1분간 원심분리합니다.
7. 반복: 붉은 색이 완전히 사라질 때까지(분리된 세포에 적혈구가 없을 때까지) 5번과 6번 과정을 반복합니다.
8. 최종 세척: 상층액을 완벽히 제거하고 PBS 1 ml를 넣어 세포를 잘 풀어줍니다.
9. 완료: 3,000 × g에서 1 minute 동안 원심분리한 후 PBS를 완전히 제거하면 깨끗한 백혈구만 남습니다.