살아있는 미생물 정량 | Bacteria Viability PCR | 고마바이오텍

Viability PCR (v-PCR)이란?

• Viability PCR은 살아있는 미생물의 신속한 검출을 위한 기술로, 시간이 많이 걸리는 배양 방법과 달리 빠르고 민감합니다.
• 일반적인 qPCR 방법이 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하지 않는 반면, Viability PCR은 살아있는 미생물만 증폭하므로, 감도 및 특이성이 높습니다. 
• 박테리아 뿐 아니라 효모, 바이러스, 진핵생물, archaea 및 다른 유기체에도 적용할 수 있습니다. 
• PMAxx와 PMA는 DNA에 대한 높은 친화력을 갖는 photoreactive dye로, dsDNA에 삽입된 후 가시광선에 노출되면 공유결합을 형성합니다. 살아있는 세포에서는 세포막을 투과하지 못하므로, 세포막이 손상된 죽은 박테리아의 DNA에만 결합하여 DNA 변형을 유발함으로써 높은 Ct와 증폭 지연을 유도하여, live cell과 구분됩니다. 
  

V-PCR 원리 

PMAxx™ 또는 PMA와 같은 Viability PCR 염료는 세포막을 통과하지 못하는 특성이 있어, 사멸 세포에만 특이적으로 작용합니다. 일단 사멸 세포 내부로 들어가면, 이 염료들은 DNA와 결합합니다. 이후 강한 가시광선에 노출되면 염료가 반응성을 갖게 되며, DNA와 공유 결합을 형성합니다. 이러한 DNA 변형은 후속 PCR 반응에서 유전자가 증폭되는 것을 막아줍니다.

v-PCR 워크플로우 

기본적인 v-PCR의 실험 단계(Workflow)는 다음의 5단계로 이루어집니다: 

1) 염료 첨가 (Dye addition) : 샘플(박테리아, 바이러스 등)에 PMA 또는 PMAxx™ 염료를 넣는 단계입니다.

2) 배양/반응 시간 (Incubation) : 빛을 차단한 상태(암소)에서 일정 시간 놓아둡니다. 이 과정 동안 염료가 죽은 세포의 손상된 세포막을 통과해 들어가 DNA와 결합하게 됩니다.

3) 빛 노출 (Light exposure) : 강한 가시광선(주로 파란색 LED 불빛)을 쬐어주는 단계입니다. 빛을 받으면 염료가 활성화되어 죽은 세포의 DNA와 단단한 화학적 결합을 형성합니다. (동시에 세포 밖에 남은 여분의 염료는 빛에 의해 비활성화됩니다.)

4) DNA 추출 (DNA extraction) : 샘플에서 유전자 분석을 위해 DNA를 뽑아내는 일반적인 과정입니다. 이때 죽은 세포의 DNA는 이미 염료와 결합하여 변형된 상태입니다.

5) qPCR (실시간 PCR) : 추출한 DNA를 기계에 넣고 돌립니다. 염료가 붙은 죽은 세포의 DNA는 복제(증폭)가 방해되어 신호가 잡히지 않고, 살아있던 세포의 DNA만 정상적으로 증폭되어 데이터로 확인됩니다. 

주요 제품

▒ PMA (#40019) & PMAxx™ (#40069)

PMA는 일반적으로 qPCR을 통해 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 구별하는 데 효과적이지만, 죽은 세포의 DNA로부터 나오는 PCR 생성물(결과물)을 완전히 제거하지는 못합니다. 이는 잠재적으로 위양성(가짜 양성) 결과를 초래할 수 있습니다. PMAxx™는 PMA를 능가하는 우수한 대안이 되도록 설계한 제품입니다. PMAxx™는 죽은 세포 DNA의 PCR 증폭을 제거하는 데 훨씬 더 효과적이며, 따라서 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 가장 확실하게 구별해 줍니다.

• PMA (propidium monoazide)는 dsDNA에 high affinity binding 하는 photo-reactive dye 입니다.
• PMA dye는 dead cell의 membrane만 통과하여 dsDNA에 binding되고 visible light에 의해 DNA를 변형시킵니다. 이렇게 modified 된 dsDNA는 qPCR 진행시 증폭되지 않습니다. 즉, 살아있는 bacteria만 PCR이 진행됩니다.
• PMAxx는 PMA에 비해 superior activity를 갖는 new dye로, dead cell의 PCR을 막아 위양성 위험을 최소화 합니다.

Cat. No.	Product	특징
40069	PMAxx™, 20 mM in H2O	- Next-generation v-PCR dye - Gives the best live/dead discrimination
40013	PMA Dye	- Original v-PCR dye developed at Biotium
40019	PMA Dye, 20 mM in H2O	- Validated in hundreds of publications and a   wide variety of organisms

 

 

qPCR을 진행하기 전에 살아있거나 죽은 박테리아에 PMA 또는 PMAxx™를 각각 처리했습니다. PMA 또는 PMAxx™를 처리한 죽은 박테리아는, 살아있는 세포나 (염료를) 처리하지 않은 죽은 세포에 비해 증폭이 지연되는 것을 보여줍니다. PMAxx™를 처리한 박테리아는 PMA를 처리한 박테리아보다 더 큰 증폭 지연을 보입니다. 따라서 PMAxx™는 생존력 PCR(viability PCR)을 통해 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 더 잘 구별해 낼 수 있습니다.

▒ PMA Enhancer (#31038)  

그램 음성균용 PMA Enhancer는 v-PCR에서 살아있는 그램 음성균과 죽은 그램 음성균 간의 구별 능력을 향상시키기 위해 개발되었습니다. 그램 음성균의 유전자 서열을 PCR로 증폭할 때, 이 Enhancer를 미리 처리한 샘플은 살아있는 세포로부터 나오는 신호에는 아무런 변화 없이, 죽은 세포로부터 나오는 신호만 감소하는 것을 보여줍니다. PMA Enhancer는 PMA 뿐만 아니라 PMAxx™와도 함께 사용할 수 있습니다. 

• 살아있는 그람 음성균과 죽은 그람 음성균의 구별을 위해 이용됩니다. 
• Enhancer를 처리한 시료에서는 죽은세포의 신호가 감소합니다. 
  
• PMA, PMAxx에 호환됩니다.  

대장균(E. coli)을 약한 열처리(56°C에서 3시간)로 사멸시킨 후, PMAxx™ 단독 또는 PMAxx™ + Enhancer를 함께 처리했습니다. 이어서 PMA-Lite™ 장비를 이용해 빛을 쬐어주고, DNA 정제 과정을 거친 뒤, Fast EvaGreen® qPCR Master Mix를 사용해 qPCR을 수행했습니다. dCt 값은 염료를 처리한 샘플의 Ct 값에서 염료를 처리하지 않은 샘플의 Ct 값을 빼서 계산했습니다. 그 결과, PMAxx™ + Enhancer를 함께 처리한 죽은 세포들만 큰 dCt 값을 보였으며, 이는 염료가 죽은 세포 DNA의 PCR 반응을 성공적으로 억제했음을 나타냅니다.

▒ Starter Kits for V-PCR

• 살아있는 세포만 PCR을 통해 정량하는 방법인 Viability PCR에 필요한 시약을 제공하는 킷트입니다.
• Complex sample, mixed culture 샘플에 모두 사용할 수 있습니다.
• 그람음성 세균의 live/dead 식별을 돕기위한 PMA Enhancer를 추가로 선택할 수 있습니다.
  
• 구성 : 
  - PMA dye or PMAxx™ dye
  - PMA Enhancer for Gram Negative Bacteria (31076/31076-X only)
  - Forget-Me-Not™ EvaGreen® qPCR Master Mix
  - ROX reference dye