1. CUTANA™ ATAC-seq Kit는 어떤 샘플 유형에 사용할 수 있나요?
CUTANA™ ATAC-seq 키트는 진핵세포(생세포, 동결 보존 세포, 부착 세포, 부유 세포 포함) 및 급속 동결 조직(신선하게 추출된 핵 및 동결 보존된 핵 포함)과 호환됩니다. 동결 보존된 핵을 시작 물질로 사용하는 경우 매뉴얼의 세포 수확 및 핵 추출 단계(Section II: Nuclei Extraction의 6–15단계)를 건너뛰십시오.
참고사항:
샘플 품질과 핵 준비 상태는 실험의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 태그멘테이션(tagmentation) 전 핵 품질을 평가하는 방법은 이 문서를 참조하십시오.
조직 해리 및 핵 분리는 ATAC-seq 워크플로우 전단에서 샘플별 최적화가 필요할 수 있습니다. 핵 추출을 위한 조직 처리 관련 일반적인 지침은 이 문서를 참조하십시오.
2. ATAC-seq을 위한 고품질 샘플 준비 상태는 어떻게 확인하나요?
고품질의 샘플 준비는 신뢰할 수 있는 ATAC-seq 분석의 핵심입니다. 각 실험 전 초기 세포 수확 및 핵 추출 단계 모두에서 샘플 준비가 성공적으로 이루어졌는지 확인하십시오.
초기 세포 수확 (그림 1A):
1. ATAC-seq 반응에는 생세포가 가장 이상적이지만, 적절하게 동결 보존된 세포나 핵도 CUTANA ATAC-seq 키트 워크플로우와 호환됩니다. ATAC-seq의 시작 물질로 급속 동결된 세포나 핵을 사용하지 마십시오.
2. 세포는 정확한 세포 수 측정을 위해 핵 추출을 진행하기 전, 트라이판 블루(Trypan blue) 염색 시 밝은 흰색을 띠어야 하며(높은 트라이판 블루 배제율; 파란색으로 염색된 사멸 세포는 빨간색 원 참조), 단일 세포 부유액 상태여야 합니다. 세포 뭉침 현상이 심하게 관찰되는 경우, 다음 방법을 고려하여 복구하십시오:
- 온화한 효소 해리 (접착력이 강한 경우): 세포가 조직이나 부착 배양에서 해리된 경우, 잔여 접착 단백질이 손상되지 않은 상태로 남아있을 수 있습니다. 비효소해리 완충액(예: CellStripper 또는 Versene)이나 Accutase, TrypLE와 같은 저농도의 온화한 효소로 실온에서 2–3분간 짧게 처리한 후, FBS 또는 BSA가 포함된 배지로 즉시 반응을 억제하고 좁은 구멍의 피펫 팁으로 부드럽게 피펫팅(triturate)하십시오.
- 부드러운 피펫팅: 표준 P200 피펫을 사용하여 부유액을 10–15회 위아래로 피펫팅합니다. 유체 전단력이 세포 간의 물리적 결합을 끊어줄 수 있습니다.
- 20–30 µm 메쉬 스트레이너 통과: 뭉친 세포는 물리적으로 걸러내고 단일 생세포만 통과시킵니다 (주의: 뭉친 세포는 손실됨).
3. 생세포는 이상적으로 >90%의 생존율을 보여야 하며, 적절히 동결 보존된 세포는 해동 직후 >85%의 생존율을 보일 것으로 기대됩니다. 시작 세포의 생존율이 낮거나 오염된 것으로 보인다면 세포 배양 조건을 최적화하십시오.
핵 추출 (그림 1B – 약간의 세포 파쇄물이 있는 상태로 표시됨):
1. 추출된 핵은 >95%가 "사멸된" 상태(트라이판 블루에 염색됨)로 보여야 합니다.
2. 핵은 경계가 명확하고 뭉쳐있지 않아야 합니다(응집률 <25% 수준). 핵 뭉침 현상이 심하게 관찰되는 경우, 세포 수확 단계를 최적화하거나(시작 세포가 뭉쳤던 경우), 뭉침을 최소화하면서 최적의 추출 효율을 달성할 수 있도록 용해 시간을 최적화하십시오.
3. 핵 추출 후 약간의 세포 파쇄물(cell debris)이 존재하는 것은 하류(downstream) 데이터 품질에 부정적인 영향을 미치지 않습니다.
4. 가능하다면 표준 ATAC-seq 반응당 5만 개(50k)의 인간 핵을 목표로 사용하십시오.
그림 1. A) 건강한 세포는 트라이판 블루(Trypan blue)를 배제하여 명확한 경계와 함께 밝은 흰색으로 보입니다. 빨간색 화살표 및 원: 트라이판 블루를 흡수한 사멸 세포 또는 핵입니다. B) 건강한 핵은 트라이판 블루를 흡수합니다. 크기와 모양이 비교적 균일하며 명확한 경계를 가집니다. 세포 파쇄물(Cell debris) 역시 파란색으로 염색되어 핵 사이에 존재합니다.
3. 소량(Low-input) ATAC-seq 샘플에는 어떻게 접근해야 하나요?
EpiCypher는 1,000개에서 50,000개의 인간 핵을 사용하여 CUTANA™ ATAC-seq 키트의 사용을 검증하였으며, 다양한 투입량 전체에서 동등하고 신뢰할 수 있는 열린 염색질 프로파일(open chromatin profiles)을 생성했습니다. 출발 물질이 제한적인 새로운 샘플 유형의 경우, 일상적인 실험에 적용하기 전에 안정적으로 우수한 ATAC-seq 데이터를 생성하는 최저 투입량을 결정할 수 있도록 투입량 적정(input titration) 테스트를 통해 워크플로우 성능을 먼저 검증하는 것을 권장합니다.
4. TapeStation/Bioanalyzer 결과가 이상적이지 않더라도 샘플 시퀀싱을 진행해야 하나요?
이상적인 ATAC-seq 라이브러리는 150-1,000 bp 사이에서 사다리(laddering) 패턴을 보이며, PCR 수행 후 분자량 크기는 조각(fragment) 길이, Tn5 모자이크 어댑터, 그리고 멀티플렉싱 프라이머의 합을 반영합니다. 고품질의 결과 분석(trace)에는 서브뉴클레오솜(subnucleosomal, ~200 bp) 및 모노뉴클레오솜(mononucleosomal, ~300 bp) 조각에 해당하는 피크(peak)가 포함되어야 합니다. 디뉴클레오솜(dinucleosomal, ~500 bp) 또는 트리뉴클레오솜 피크까지 관찰될 수 있으며, 이는 라이브러리 품질에 영향을 미치지 않습니다.
5. CUTANA™ ATAC-seq 데이터는 어떻게 분석하나요?
ATAC-seq 분석 방법은 CUT&RUN 및 CUT&Tag 데이터셋에 사용되는 방법과 유사합니다. 요약하자면:
- ATAC-seq은 일반적으로 열린 염색질 영역에서 서브뉴클레오솜 크기의 조각을 생성합니다. 정렬 전에 시퀀싱 어댑터를 잘라내는(trimming) 것을 강력히 권장하는데, 시퀀싱 리드 길이보다 짧은 모든 유전체 조각은 어댑터 서열을 포함하며 유전체에 매핑되지 못하기 때문입니다. 2x50 bp에서는 이것이 시퀀싱 리드의 ~5%만을 나타낼 수 있지만, 2x100 bp에서는 리드 깊이의 25%나 차지할 수 있습니다. 이를 위한 목적으로 Trimmomatic 및 Trim Galore와 같은 도구가 권장됩니다.
- Bowtie2 [1]를 사용하여 정제되지 않은 리드(raw reads)를 참조 유전체에 정렬합니다. Integrative Genomics Viewer (IGV) [2] 및/또는 deepTools2 [3]를 사용하여 농축(enrichment)을 시각화할 수 있습니다 (예: 유전체 브라우저 상에 그래프로 표시된 bigWig 파일).
- 피크 콜링(peak calling)을 위해, EpiCypher는 MACS2 (Narrow) [4]를 자주 사용하며, 이는 ATAC-seq의 열린 염색질 프로파일에 적합한 날카로운 농축 피크 분석에 맞게 조정될 수 있습니다 [5].
- 배경 대비 신호를 결정하기 위해, EpiCypher는 bedTools를 사용하여 피크 내 리드 비율(FRiP)을 계산하고 실험 샘플 대 대조군의 FRiP 점수를 비교합니다 [6]. 차등 분석 및 히트맵 생성을 위해 다른 도구들(예: DESeq2 [7], deepTools2 [3])을 적용할 수 있습니다.
ATAC-seq 데이터 분석에 대한 더 많은 팁은, 여기의 ENCODE 가이드라인을 따르십시오.
6. ATAC-seq 데이터에서 미토콘드리아 리드 비율이나 중복 비율(duplicates)이 높게 나오는 이유는 무엇인가요? 어떻게 트러블슈팅할 수 있나요?
높은 미토콘드리아 리드 비율 (High mitochondrial reads) :
- 고품질 ATAC-seq 라이브러리는 미토콘드리아 리드 비율이 15% 미만(<15%)일 것으로 기대됩니다.
- 미토콘드리아 리드 비율은 샘플 유형에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
- 미흡한 샘플 준비 과정은 미토콘드리아 잔류량을 증가시킬 수 있습니다. ATAC-seq을 위한 샘플 준비 지침은 이 문서를 참조하십시오.
- 핵 추출 후 상등액이 불충분하게 제거되면 미토콘드리아 신호가 증가하는 원인이 됩니다. 원심분리 후 핵 펠렛(pellet)이 흔들리지 않도록 유지하고, 상등액을 가능한 한 최대한 제거하십시오 (매뉴얼 17단계).
높은 중복률 (High duplicate rate) :
- 고품질 ATAC-seq 라이브러리는 중복 리드(duplicate reads) 비율이 25% 미만(<25%)일 것으로 기대됩니다.
- 낮은 핵 투입량(low nuclei input), 낮은 샘플 유형 복잡도(low sample-type complexity), 그리고 증가된 PCR 증폭 사이클 수(소량 샘플을 위해 수행된 경우)는 라이브러리 복잡도를 감소시키고 중복률을 높일 수 있습니다.
- 소량 샘플 최적화에 대한 지침은 이 문서를 참조하십시오.
7. CUTANA™ ATAC-seq Kit에 자체 보관 중인 1X PBS를 사용해도 되나요?
다른 방식으로 제조된 1X PBS의 사용은 권장하지 않습니다. 문헌 및 상용 공급업체에 따라 다양한 PBS 레시피가 존재하지만, 이는 핵 추출 및 태그멘테이션(tagmentation) 과정에서 현저히 다른 결과를 초래할 수 있습니다. CUTANA ATAC-seq 키트에 제공되는 10X PBS는 CUTANA ATAC-seq 워크플로우에서 엄격한 검증을 거쳤으며 최적의 성능을 입증했습니다. 기준에 미치지 못하는 PBS를 사용할 경우 추출 후 핵의 품질이 저하될 수 있습니다. (그림 1). 추가적인 10X PBS가 필요한 경우 문의주세요.
그림 1. 서로 다른 출처의 PBS를 사용했을 때의 핵 추출 양상. A) CUTANA ATAC-Seq 키트의 PBS를 사용하여 최적으로 추출된 핵. B) 다른 레시피의 PBS를 사용하여 추출된 핵. A)의 핵과 비교했을 때 핵의 팽창(swelling)과 더 낮은 막 손상도가 관찰됨에 주의하십시오.
8. 8-strip tube 호환 thermomixer가 없어도 CUTANA™ ATAC-seq Kit를 사용할 수 있나요?
네, 사용 가능합니다. 태그멘테이션(tagmentation) 반응 시 고정형 서모사이클러(static thermocycler)를 대체품으로 사용할 수 있습니다. 동일한 태그멘테이션 시간과 온도를 유지하되, 30분 동안 진행되는 반응 과정 중 10분 간격으로 샘플을 꺼내 잠시 vortexing해 주십시오.
9. CUTANA™ Tn5 Transposome은 얼마나 안정적인가요? -80ºC 보관 상태에서 동결/해동(freeze/thaw)을 반복하면 활성이 저하되나요? 효소를 분주(aliquot)해 두어야 하나요?
CUTANA™ Tn5 Transposome은 -80ºC에서 동결 후 얼음 위에서 해동할 경우, 최대 10회의 동결/해동 사이클까지 눈에 띄는 활성 손실이 관찰되지 않습니다. 해당 소분 물량을 10회 이상 나누어 사용할 것으로 예상되는 경우, 처음 해동할 때 더 작은 단위로 분주(aliquot)해 두십시오. 4ºC 이상의 온도에서 장기 보관하는 것은 권장하지 않으며, 며칠에서 수 주 내에 명확한 활성 저하가 발생합니다.
10. CUTANA™ Tn5 Transposome만 단독으로 사용하는 경우 추천하는 DIY ATAC-seq 프로토콜이 있나요?
CUTANA™ ATAC-seq 키트는 Omni-ATAC-seq 프로토콜 [1]을 기반으로 변형된 최적화 워크플로우를 사용합니다. 본 키트는 적은 양의 핵(nuclei input)을 사용할 때도 신속성, 사용 편의성, 그리고 우수한 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 확보할 수 있도록 실험법을 간소화한 개선 사항들을 포함하고 있습니다. 이미 기존에 확립된 워크플로우가 있는 경우, CUTANA™ Tn5 Transposome을 현재 사용 중인 효소 대신 바로 교체(drop-in replacement)하여 사용할 수 있습니다. 자체 ATAC-seq 프로토콜 구축에 대한 자세한 정보는 Omni-ATAC-seq 논문 [1]을 참조하십시오.
11. CUTANA ATAC-seq Kit 또는 Tn5 Transposome과 함께 사용할 수 있는 프라이머에는 어떤 것이 있나요?
최상의 결과를 위해 CUTANA™ Nextera-Compatible CDI Primer Set 1 (EpiCypher 14-1190-24rxn) 사용을 권장합니다. 이 Nextera 호환 ATAC 프라이머는 일반 Nextera 프라이머보다 몇 베이스(base) 더 길며, EpiCypher의 PCR 조건 하에서 기존 Nextera 프라이머 대비 더욱 효율적으로 라이브러리를 생성합니다. 바코드 정보가 포함된 프라이머 서열은 여기에서 다운로드하실 수 있습니다.
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