특징
SEQURNA는 단일 세포 분석(scRNA-seq) 시 RNA 파괴를 막아주는, 열과 가혹 조건에 극도로 강한 합성 RNase 저해제 입니다.
- 합성 내열성(Thermostable) 시약: 단백질 기반인 기존 재조합 저해제(RRI)와 달리 합성 제품으로, 가열이나 열 조건에서도 안정하게 작동합니다.
- 뛰어난 열/물리적 안정성: pH 변화, 열 처리, 반복적인 동결-해동, 강한 볼텍싱 등 실험실의 가혹한 조건에서도 효능을 유지합니다.
- 우수한 라이브러리 품질: 기존 RRI 대비 동등하거나 더 뛰어난 품질의 단일 세포 라이브러리를 구축할 수 있습니다.
- 유연한 워크플로우: Tn5 효소 반응과 호환되며, Smart-seq3xpress 등 최신 프로토콜에서 기존 RRI를 대체하여 실험 작업 가능 시간(Time-window)을 크게 늘려줍니다.
- 지원 프로토콜: FLASH-seq, Smart-seq2, Smart-seq3, Smart-seq3xpress 등 주요 단일 세포 분석 프로토콜에 바로 적용 가능합니다.
프로토콜
[예] FLASH-seq (고성능 단일 세포 RNA 시퀀싱) 프로토콜 요약
1. 주요 주의사항
- DTT(Dithiothreitol) 완전 배제: [매우 중요] Lysis 및 RT 반응에 DTT를 절대 넣지 않습니다. DTT를 첨가하면 프로토콜 성능이 저하됩니다.
- RT Mix에 추가 RNase Inhibitor 금지: Lysis단계에 들어간 SEQURNA가 열처리 및 역전사(RT) 전 과정 동안 활성을 유지하므로, RT Mix에 추가 RNase 저해제를 넣으면 안 됩니다.
- 최적의 SEQURNA 농도: 최종 RT-PCR 단계 기준 0.75 ~ 1 U/µL가 가장 적합하며, 기존 RRI(단백질 기반 저해제) 대비 유전자 검출 능력이 상향되었습니다.
- 실험 장비 및 자재: 384-웰 LoBind(저결합) 플레이트 사용 권장 (물질 손실 방지). 384-웰 플레이트는 얼음 위 전도성 쿨링 랙(SEQblock™ 등)에 올려 보관하여 결로 현상 및 블록 오염 방지.
2. 단계별 프로토콜 요약
1) Lysis Mix 준비 (15분):
[주의] DTT 미첨가
Triton-X100, dNTP, SMART dT30VN primer, SEQURNA(5 U/µL), Betaine, Nuclease-free water를 혼합하여 Lysis Mix를 만듭니다. (384-웰에 웰당 1 µL 분배)
보관: -20 ºC에서 6개월 이상 보관 가능.
2) 샘플 수집 (10분) :
1 µL의 Lysis Mix가 들어있는 384-웰 플레이트에 단일 세포(single cell)를 소팅(Sort)합니다.
팁: 소팅 후 바로 진행하더라도 드라이아이스에 5분간 놓아 두었다가 해동/열처리하면 세포 용해(Lysis) 효율이 높아집니다.
3) 세포 용해 (3분) :
플레이트를 열 뚜껑(Heated lid)이 있는 Thermocycler에서 72 ºC, 3분간 인큐베이션한 후 4 ºC로 냉각합니다.
스핀다운 후 즉시 아이스 랙으로 이동합니다.
4) 역전사 및 PCR 반응 (3시간 30분) :
MgCl2, Betaine, dCTP, Maxima H- RT 효소, KAPA HiFi HotStart ReadyMix, FS TSO를 포함한 RT-PCR Mix 4 µL를 추가합니다. (추가 RNase Inhibitor/DTT 금지)
RT: 50 ºC, 60분
PCR: 98 ºC 3분 --> (98 ºC 20초 / 67 ºC 20초 / 72 ºC 5분) x 18~21 사이클 (세포종에 따라 사이클 수 조절)
5) 비드 기 cDNA 정제 (30분) :
부피 확장을 위해 샘플에 물 10 µL를 추가한 후, 0.8x 비율의 자성 비드(AMPure XP 또는 Sera-Mag)를 사용하여 cDNA를 정제합니다.
[주의] 384-웰 플레이트 및 로봇 사용 시 샘플 손실을 막기 위해 에탄올 세척(Ethanol wash) 과정은 생략합니다.
6) QC 및 정량 (1시간) :
QC: Agilent Bioanalyzer(High Sensitivity DNA chip)로 cDNA 품질 확인 (평균 크기 2.0~2.5 kb, 500 bp 미만 유무 확인)
Quantification: PicoGreen 시약을 이용하여 cDNA 농도를 정량합니다.
7) Tagmentation 및 인덱싱 PCR (1시간 10분) : Tn5 반응 및 라이브러리 제작
cDNA를 200 pg/µL로 희석(Normalization)한 후, Tn5 전이효소(Transposase) 및 DMF를 포함한 Tagmentation Mix 3 µL와 반응(55 ºC 8분)시킵니다. SDS 0.2%로 반응을 멈춘 뒤, 어댑터(Index Adaptor)와 KAPA HiFi를 첨가하여 Enrichment PCR(12 사이클)을 진행합니다.
8) 최종 정제 및 시퀀싱 (45분+) : NGS 분석 준비
Sera-Mag 비드(0.8x 비율)로 라이브러리를 최종 정제하고, 80% 에탄올 세척 과정을 거칩니다. Qubit 및 Bioanalyzer로 농도와 크기를 확정한 후 Illumina, Element Bio 등 NGS 장비로 시퀀싱합니다.