엔도톡신이 효소와 반응하여 형광 물질을 방출하게 되는데, 1시간 동안 얼마나 많은 형광 값이 증가했는지(Delta RFU)를 측정하는 방식입니다.
1. 시료 준비 및 플레이팅 (Preparation)
96-well 플레이트에 표준 엔도톡신(Standard), 음성 대조군(Blank), 그리고 분석할 샘플을 각각 분주합니다.
여기에 유전자 재조합 C인자(rFC)와 형광 기질이 포함된 반응 시약을 첨가합니다.
2. 초기 형광 값 측정 (Zero Hour Reading: T0)
시약을 넣은 직후, 형광 플레이트 리더기를 사용하여 초기 형광 값을 측정합니다.
Excitation 380nm, Emission 440nm ; 이 값은 배경값(Background)으로 사용됩니다.
3. 효소 반응 및 배양 (Incubation)
플레이트를 37°C(±1°C) 온도로 설정된 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
샘플 내에 엔도톡신이 있다면 rFC 효소가 활성화되고, 활성화된 효소가 형광 기질을 잘라내어 빛을 내는 형광 물질을 방출하게 됩니다.
4. 최종 형광 값 측정 및 변화량 계산 (Final Reading & Delta RFU)
1시간 후, 동일한 파장에서 최종 형광 값을 측정합니다.
형광 변화량(Delta RFU) 계산: (1시간 후 측정값) - (0시간 초기값)
여기에 음성 대조군(Negative Control)의 변화량을 빼서 순수한 반응값(Net Delta RFU)만을 산출하여 보정합니다.
5. 농도 산출 (Data Analysis)
표준 엔도톡신의 농도와 형광 변화량 사이의 로그-로그(Log-Log) 선형 관계를 이용하여 검량선(Standard Curve)을 작성합니다.
검량선 방정식에 샘플의 형광 값을 대입하여 엔도톡신 농도(EU/mL)를 최종 결정합니다.
5가지 서로 다른 생물학적 제제에 첨가된 엔도톡신의 회수율을 평가한 결과, GenScript 키트가 가장 정확한 회수율을 제공하는 것으로 나타났습니다.