단백질의 Cysteine 프로파일링을 위한 NAIA Probe | 고마바이오텍

특징

• NAIA (N-Acryloylindole-alkyne)는 단백질 내의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 Broad-spectrum cysteine-reactive probe입니다.
• 특정 단백질 하나만 표적하는 것이 아니라, 세포 내에 존재하는 수많은 반응성 시스테인들을 광범위하게 라벨링 하므로 전체적인 시스테인 프로파일링에 유리합니다.
• 시스테인(CYS)과의 반응 속도 상수(k)가 10^2 M-1s-1 이상으로 매우 빠릅니다.
• 기존에 널리 쓰이던 IA-Alkyne(아이오도아세트아미드 계열)보다 더 넓은 범위의 약물 결합 가능 시스테인(Ligandable cysteines)과 단백질들을 찾아낼 수 있습니다.
• IA-Alkyne에 비해 시스테인(CYS)에 대한 선택성이 매우 높습니다. 특히 유사한 반응을 보일 수 있는 세린(SER)이나 라이신(LYS) 잔기보다 시스테인에 우선적으로 결합하며, 화학적 안정성 또한 뛰어납니다.
• 세포 독성이 없으므로 살아있는 세포 내에서 단백질의 변화를 정밀하게 추적하고 이미징하는 데 최적화되었습니다.
• 특히 신약 개발 초기 단계에서 특정 화합물이 어떤 시스테인 잔기를 차단하는지 전수 조사할 때 매우 강력한 도구입니다.

데이터

HepG2 세포를 완전 배양액 내에서 10uM 농도의 NAIA와 함께 60분 동안 배양하였습니다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정한 뒤 세포막 투과화 처리를 거쳤습니다.이어서 20uM 농도의 Azide-fluor 545와 함께 CuAAC (클릭 화학)을 상온의 암실에서 1시간 동안 진행하였습니다. 염색된 세포를 다시 PBS로 세척한 다음, 8.2uM 농도의 Hoechst(핵 염색제)와 함께 15분간 추가로 배양하였습니다.마지막으로 세포를 PBS로 세척한 후 공초점 형광 현미경을 이용하여 이미징을 수행하였습니다. 

HepG2 세포를 무혈청 배양액 상태에서 용매 대조군(vehicle), H₂O₂(1 mM), 또는 H₂O₂(1 mM) + NAC(5 mM)로 37°C에서 15분간 처리하였습니다. 그 후, 살아있는 세포 내의 free thiols를 라벨링하기 위해 NAI(50 µM)와 함께 10분간 배양하였으며, 이어서 세포 lysis 및 TCEP(1 mM)를 이용한 환원 반응을 1시간 동안 진행하였습니다. -20°C에서 밤새도록 아세톤 침전(acetone precipitation) 과정을 거친 후, 단백질들을 PBS 내에서 NAIA-5(100 µM)로 라벨링하였습니다. 마지막으로 샘플들을 질량 분석(MS)용으로 준비하여 LC-MS/MS를 통해 분석을 수행하였습니다.

PBS 내의 HepG2 세포 파쇄액(100ug)을 NAIA와 함께 60분 동안 배양하였으며, 이어서 25uM 농도의 Azide-fluor 545와 함께 CuAAC 반응을 진행하였습니다. 그 후, 단백질 혼합물을 샘플링 버퍼와 함께 가열하였으며, SDS-PAGE(단백질 전기영동)로 분리한 뒤 이미징 분석을 수행하였습니다.