CUTANA Fiber-seq Kit

시약 및 기기 상세

Maker : EPICYPHER

Fiber-seq은 기존의 짧은 리드(Short-read) 방식과 달리, 단일 DNA 분자에서 유전 정보와 후성유전 정보를 동시에 획기적으로 읽어내는 과정입니다. ATAC-seq(접근성), Bisulfite-seq(메틸화), WGS(변이) 실험을 Fiber-seq 한번으로 해결할 수 있습니다.

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특징

Fiber-seq은 크로마틴 접근성, DNA 메틸레이션, 유전적 변이를 동시에 프로파일링 합니다.
일반적으로 ATAC-seq, ChIP-seq, Bisulfite sequencing 등의 여러 개별 시험이 필요한 분석을 long-read sequencing (LRS) 기반의 실험 한 번으로 통합 데이터를 얻을 수 있습니다.
세포에서 시작하여 라이브러리 준비가 가능한 DNA까지 얻는데 필요한 핵심 시약을 모두 포함하고 있습니다.
User Manual에는 상세한 프로토콜, QC 항목, FAQ, 전문가 팁까지 포함되어 실험을 쉽게 시작할 수 있습니다. (간단한 요약 프로토콜 포함 제공)
Fiber-seq은 일반적인 LRS 라이브러리 준비 직전에 2시간 이내로 수행할 수 있으며 주요 LRS 플랫폼의 라이브러리 준비 kit와 호환성이 검증된 시약을 사용합니다.
Hia5는 현재 사용 가능한 6mA methyltransferase 중 가장 활성이 높은 효소이며 본 kit에 독점적으로 포함됩니다.
높은 효소 활성으로 더 짧은 반응 시간을 가능하게 하여 protein footprint의 해상도가 향상됩니다.
각 Lot은 일관된 결과를 보장하기 위해 철저한 QC 검사를 통과하여 출시됩니다.
Kit를 통해 얻은 정제된 genome DNA는 PacBio® HiFi Sequencing, Oxford Nanopore Technologies®(ONT) Nanopore Sequencing 의 라이브러리 준비 워크플로우에 직접 사용할 수 있습니다.
Fiber-seq의 권장 입력량은 반응 당 1,000,000개의 사람 유래 native nuclei입니다.
냉동 보관된 핵이나 약하게 cross-link된 핵에도 성공적으로 적용되었습니다.

Kit 구성품

Component	Cat. No.
CUTANA™ Hia5 For Fiber-seq	15-1032
CUTANA™ Fiber-seq Kit SAM	21-1034
CUTANA™ Fiber-seq Kit Pre-1X Reaction Buffer	21-1033
CUTANA™ Pre-Nuclei Extraction Buffer	21-1021
1 M Spermidine	21-1005
Proteinase K	15-1033
RNase A	15-1034
gDNA Spin Columns	10-0016
gDNA Collection Tubes	10-0017
gDNA Cell Lysis Buffer	21-1029
gDNA Binding Buffer	21-1030
gDNA Wash Buffer	21-1031
gDNA Elution Buffer	21-1032

추천 Library Prep Kit

For PacBio HiFi platform: PacBio SMRTbell Library Prep Kit (e.g., SMRTbell prep kit 3.0)
For ONT Nanopore platform: ONT Ligation Sequencing Kit (e.g., Ligation Sequencing Kit V14)

실험 과정

분리된 핵은 Hia5 N⁶-methyladenine methyltransferase (6mA MTase)와 보조 인자 S-Adenosylmethionine(SAM)를 함께 반응시켜 접근 가능한 크로마틴 영역 내의 아데닌을 선택적으로 메틸화합니다.
10분 간 라벨링을 진행한 후, 반응을 정지시키고 genome DNA (gDNA)를 정제하여 long-read sequencing에 사용할 수 있도록 준비합니다.
Long-read sequencing 데이터는 이후 단일 분자 수준에서 분석되어 샘플 내 크로마틴 구조의 이질성을 파악하거나 크로마틴 접근성 및 DNA 메틸화의 샘플 전반적인 패턴을 식별하는데 활용됩니다.

Step 1: 핵 분리 (Nuclei Isolation)

샘플(세포 또는 조직)에서 온전한 상태의 핵(Nuclei)을 분리합니다.

Step 2: Hia5 효소 처리 및 레이블링 (Labeling)

분리된 핵을 CUTANA™ Hia5와 함께 배양합니다.Hia5는 N6-methyladenine methyltransferase(6mA MTase)로, 단백질이 붙어 있지 않은 열린 염색질(Accessible chromatin) 영역의 아데닌(A)에만 선택적으로 메틸기(6mA)를 붙입니다.

Step 3: 반응 정지 및 DNA 정제 (Quench & Purification)

약 10분간의 짧은 레이블링 단계가 끝나면 반응을 중단(Quench)시킵니다.

이후 세포 내에서 게놈 DNA(gDNA)를 순수하게 추출하고 정제합니다.

Step 4: 시퀀싱 준비 (Library Prep)

추출된 gDNA를 롱리드 시퀀싱을 위한 프로토콜(Direct 또는 Native DNA sequencing)에 맞춰 준비합니다.

별도의 복잡한 변환 과정 없이 천연 상태(Native)의 DNA를 그대로 사용합니다.

Step 5: 롱리드 시퀀싱 및 데이터 분석 (LRS & Analysis)

PacBio® HiFi 또는 Oxford Nanopore(ONT) 플랫폼을 이용해 시퀀싱을 진행합니다.

단일 실험으로 6mA 레이블링 (Hia5가 칠해진 곳을 통해 염색질 접근성 파악) 및 내인성 5mC 메틸화 (DNA에 원래 존재하던 CpG 메틸화 정보 파악) 정보를 동시에 확보합니다.

참고 데이터

Fiber-seq은 염색질 접근성(Chromatin accessibility)과 내인성 DNA 메틸화를 동시에 포착합니다.

CUTANA™ Fiber-seq은 인간 백혈병(K562) 세포에서 열린 염색질(Open chromatin, 6mA로 표시됨)과 DNA 메틸화(5mC)를 동시에 검출합니다. 가장 위쪽의 Fiber-seq 트랙은 총합된 6mA 신호를 보여줍니다. 비교를 위해 ATAC-seq 데이터와 CTCF CUT&RUN 데이터가 함께 표시되어 있습니다. CTCF는 염색질 구조를 조절하는 DNA 결합 단백질이며, 주로 열린 염색질 영역에 많이 분포(농축)되어 있습니다. Fiber-seq 패널의 각 가로선은 하나의 긴 읽기(single long read)를 나타내며, 60개의 개별 염색질 섬유로부터 얻은 단일 DNA 분자 단위의 데이터를 제공합니다.

Fiber-seq은 ATAC-seq보다 더 높은 해상도로 전 유전체(genome wide)에 걸친 footprints을 보여줍니다.

30개의 개별 DNA 분자에서 얻은 Fiber-seq 데이터를 보여줍니다. 맨 위 트랙은 열린 염색질을 나타내는 6mA 신호의 총합(pileup)을 보여줍니다. 그 아래의 각 가로선은 단일 DNA 분자를 나타냅니다. 점선 상자는 CTCF 모티프(결합 부위) 영역을 가리킵니다. Fiber-seq은 단일 분자 해상도를 제공하기 때문에, 세포 집단 전체에서 단백질 결합의 이질성(heterogeneity)이 드러납니다. (예를 들어, 가장 왼쪽 상자 영역은 6mA 라벨링이 가변적인데, 이는 분자마다 CTCF가 결합해 있는 정도가 다름을 시사합니다.) 이 Fiber-seq 실험에서 얻은 전 유전체 6mA 신호는 CTCF 결합 부위의 강력한 footprinting을 보여줍니다. 모티프 중심점 양옆으로 높아진 6mA 수치는 CTCF 결합 부위 주변의 접근 가능한 DNA를 반영하며, 실제 CTCF가 결합한 자리는 6mA 라벨링으로부터 보호(protected)되어 신호가 낮게 나타납니다.

Fiber-seq은 단 한 번의 실험으로 전 유전체에 걸친 염색질 접근성, DNA 메틸화, 그리고 추정된 뉴클레오솜 위치를 포착합니다.

히트맵(Heatmaps)은 전사 시작 부위(TSS)를 중심으로 정렬된 6mA 신호, 뉴클레오솜 위치, 그리고 내인성 5mC(DNA 메틸화) 수치에 대한 단일 분자 데이터를 보여줍니다. 6mA가 풍부한 전사 시작 부위(TSS)는 잘 정의된 뉴클레오솜 구조를 보이며, 5mC(메틸화)는 고갈되어 있습니다. 이는 활성화된 프로모터 영역의 특징과 일치합니다. 이러한 패턴은 H3K4me3(활성 전사 시작 부위) 및 H3K27me3(억제된 유전자)를 포함한 히스톤 변형의 CUT&RUN 프로필과 일치합니다.