[R&D Systems] CryoDefend-Stem Cells | 고마바이오텍

BG01V 인간 배아줄기세포를 CryoDefend® Stem Cells Media 또는 두 경쟁사의 냉동보존 배지를 사용하여 1 × 10⁶ 세포/바이알 농도로 냉동한 후, 액체질소에 1주일간 보관하였다. 이후 세포를 해동하여 세포 수를 측정하고, Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) 조건배지와 Recombinant Human FGF basic이 포함된 배지에 재현탁하여 6-well plate에 배양하였다. 4일 동안 배양한 뒤 세포를 수확하여 다시 세포 수를 측정하였다. 실험 결과, CryoDefend® Stem Cells Media를 사용한 경우가 경쟁사 제품을 사용한 경우보다 해동 직후의 생존율뿐만 아니라 4일 후 배양된 세포 수에서도 더 우수한 결과를 나타냈다. 이는 CryoDefend® 배지가 인간 배아줄기세포의 냉동 보존과 해동 후 회복에 있어 보다 안정적이고 효과적인 배지임을 시사한다.

BG01V 인간 배아줄기세포는 CryoDefend® Stem Cells Media (# CCM018), 일반적인 냉동보존 배지(90% FBS/10% DMSO), 또는 한 경쟁사의 냉동보존 배지를 사용하여 냉동 보관되었다. 해동 후에는 세포를 Mouse Embryonic Fibroblast 조건배지(AR005)와 FGF basic (# 4114-TC)이 포함된 배지에 3일간 배양하였으며, 이후 광학현미경(brightfield microscopy)을 이용하여 세포의 형태(morphology)를 관찰하였다. 이 실험을 통해 냉동보존 배지에 따른 배아줄기세포의 형태적 유지 능력을 비교할 수 있었다.

CryoDefend® Stem Cells Media (Catalog # CCM018) 또는 두 경쟁사의 냉동보존 배지를 사용하여 냉동된 BG01V 인간 배아줄기세포를 해동한 후, Mouse Embryonic Fibroblast 조건배지(AR005)에서 4일간 배양하였다. 이후, 배양된 세포의 만능성(pluripotency) 유지 여부를 평가하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)을 실시하였다. 세포는 APC 형광이 결합된 Mouse Anti-Human Oct-4A 항체(#IC6344A)와 PE 형광이 결합된 Mouse Anti-Human/Mouse SSEA-4 항체(#FAB1435P)로 염색되었으며, 이소타입 대조군을 기준으로 유세포 분석의 사분면을 설정하였다. 분석 결과, 상단 우측 사분면에 표시된 수치는 Oct-4A와 SSEA-4를 동시에 발현하는 이중 양성 세포의 비율을 나타내며, 이는 줄기세포의 만능성 유지 수준을 반영한다. CryoDefend® 배지를 사용한 세포는 경쟁사 제품에 비해 높은 수준의 이중 양성 세포 비율을 보였다.

CryoDefend® Stem Cells Media (# CCM018)를 사용하여 냉동 보존된 BG01V 인간 배아줄기세포는 해동 후 4일 동안 배양되었으며, 이후 Human Pluripotent Stem Cell Functional ID Kit (# SC027)의 설명서에 따라 **세 가지 배엽(germ layer)으로의 분화를 유도하기 위해 다시 플레이트에 분주되었다. 분화가 완료된 세포는 Human Three-Germ Layer 3-Color Immunocytochemistry Kit (# SC022)에 포함된 형광 표지 항체들을 사용하여 각 배엽 특이적 마커로 염색되었고, 핵은 DAPI(청색)로 염색되었다. 이 실험 결과는 CryoDefend® 배지를 통해 냉동 보존된 줄기세포가 해동 후에도 정상적인 삼배엽 분화 능력을 유지하며, 만능성을 보존하고 있음을 보여준다.

Rat cortical stem cells (# NSC001)은 대조 냉동 보존 배지(DMEM/F12에 N2-MAX 미디어 보충제, 10% BSA, 10% DMSO를 첨가한 것) 또는 CryoDefend® Stem Cells Media (# CCM018)를 사용하여 1×10^6 세포/vial 농도로 냉동 보존되었으며, 액체 질소에서 1주일 동안 보관되었다. 이후, 세포를 DMEM/F12에 N2-MAX 미디어 보충제와 20 ng/mL의 FGF basic (# 4114-TC)을 포함한 용액에서 해동하였다. 해동 후 세포 수를 측정한 결과(연한 파란색 막대), 세포들은 Poly-L-ornithine/Fibronectin 코팅된 플레이트에 도말되었다. 이후 4일 동안 배양하여 첫 번째 계대 배양(passage 1)을 진행하였고, 이때 다시 세포 수를 측정하였다(진한 파란색 막대). 실험은 삼중 반복으로 진행되었으며, 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.