▒ 30% PEG Isolation Method (PEG EVs)
준비물 :
• Polyethylene glycol (PEG) 6000. Prepare a 30% solution in dH2O or sterile-filtered PBS.
• Sterile-filtered PBS
Day 1 :
1. 신선하게 준비된 conditioned 배지를 꺼냅니다.
2. conditioned 배지에 30% PEG 6000을 0.5배 첨가합니다. (예: 30% PEG 10mL를 배지 20mL에 첨가)
3. 용액이 균질해 질 때까지 튜브를 뒤집어 용액을 잘 섞습니다.
4. 흔들지 않고 4°C에서 밤새도록 혼합물을 배양합니다.
Day 2 :
5. 혼합물을 4°C에서 1시간 동안 10,000 x g로 원심분리합니다. EV 펠릿은 투명하므로 펠릿이 있을 것으로 예상되는 원심분리기 바깥쪽에 있는 튜브 측면을 표시합니다.
6. EV 펠릿이 쏟아지지 않도록 주의하면서 상층액을 조심스럽게 붓습니다. 남은 PEG를 파이펫으로 조심스럽게 제거하거나 흡수성 타월에 튜브를 거꾸로 놓아 남은 상층액을 최대한 제거합니다.
7. 여과된 1X PBS(시작 샘플 20mL당 1mL)에 펠릿을 재부유시킵니다.
8. EV는 여러번 동결-해동하지 않도록 합니다. 4°C에 보관시 수개월 이내에 사용해야 하며, 장기 보관을 위해서는 aliquot하여 -20°C 또는 -80°C에서 보관합니다.
▒ qEV SEC Isolation Method (SEC EVs)
준비물 :
• Amicon® Ultra Centrifugal Filters, Regenerated Cellulose, 10K (10 kDa cutoff; Millipore Sigma Cat. No. UFC901096)
• qEVoriginal 70 nm Gen2 columns (IZON Cat. No. ICO-70)
• Sterile-filtered PBS
• Sterile-filtered PBS + 2 mM sodium azide
1-day protocol :
- qEV 컬럼을 실온에 꺼내어 둡니다.
- 신선한 conditioned 배지를 꺼냅니다.
- 제조업체의 지침에 따라 Amicon® 컬럼을 사용하여 conditioned 배지를 20mL에서 500uL로 농축합니다.
- 버퍼와 샘플이 중력에 의해 컬럼을 통과하여 수집될 수 있도록 rack에 qEV 컬럼을 설치합니다.
- 컬럼에 PBS 10mL를 처리하고 flow-through는 waste tube에서 모아 폐기합니다.
- 농축된 EV 0.5mL를 loading frit에 처리하고 컬럼에 처리한 후 flow-through는 waste tube에 모아 폐기합니다.
- PBS 1.5mL를 더 넣고 waste tube에 수집합니다.
- 컬럼 아래에 새로운 collection 튜브를 놓고 PBS 2mL를 처리합니다. 샘플 2mL를 수집합니다. 여기에 EV가 들어 있습니다.
- 2mL EV 샘플을 수집한 후, waste tube를 컬럼 아래에 다시 놓고 1.5컬럼 볼륨(15mL)의 PBS + azide를 실행하여 컬럼을 플러싱합니다. 원하는 경우 다시 사용할 수 있도록 컬럼을 4°C에 보관합니다.
- EV는 여러번 동결-해동하지 않도록 합니다. 4°C에 보관시 수개월 이내에 사용해야 하며, 장기 보관을 위해서는 aliquot하여 -20°C 또는 -80°C에서 보관합니다.
▒ Bead-Bound EVs Isolation
준비물 :
• Amicon® Ultra Centrifugal Filters, Regenerated Cellulose, 10K (Millipore Sigma Cat. No. UFC901096)
• Magnetic immunoaffinity Isolation beads (e.g., beads coupled to tetraspanin antibodies)
• A magnet stand for use with microcentrifuge tubes
• Sterile-filtered PBS
• Desired EV stains
Optional (Bead에 biotinylated capture antibody 결합)
- streptavidin magnetic bead (#28000)를 준비합니다.
- 500ul bead를 tube에 넣습니다.
- 0.5-2ug biotinylated antibody를 넣고 1시간동안 실온에서 rotating 하면서 반응시킵니다.
- 자석에 tube를 놓고 상층액을 제거한 후 500ul PBS에 재부유 합니다. 한번 더 세척과정을 거치고 다시 500ul PBS에 재부유 합니다. 이제 Beads는 EV를 분리할 준비가 되었습니다. Antibody가 binding된 bead는 0.02% azide를 넣고 4도에서 보관합니다.
분리 방법
- 신선한 conditioned 배지를 준비하고 qEV SEC 분리 지침에 따라 Amicon® 필터로 농축합니다. 각 테스트 항체 또는 염색 및 동종형 대조군에 대해 100 uL의 EV가 필요합니다.(conditioned 배지의 경우 20mL를 500 uL로 농축한 다음 그 중 100 uL를 비드에 첨가하는 것이 좋습니다).
- bead를 30초 동안 흔들어 재부유시킵니다.
- 튜브당 20 uL의 비드를 옮기고, 항체 또는 염색당 튜브 하나와 대조군을 추가합니다. 염색에 사용할 각 항체 또는 염색에 대해 비드만 있는 음성 대조군 튜브를 함께 준비하는 것이 좋습니다.
- 튜브를 자석에 1분간 올려놓고 피펫으로 상층액을 버립니다. 비드 확인이 어려우면, 튜브를 2,000 x g에서 3-5초 동안 원심분리한 다음 자석에 다시 올려놓습니다.
- 튜브를 제거하고 농축된 conditioned 배지(또는 농축 EV) 100 uL를 각 튜브에 추가합니다. (100 uL PBS를 EV가 없는 튜브에 추가합니다).
- 튜브를 실온에서 1시간 동안 rotator에서 배양합니다.