[FAQ] EvaEZ™ Fluorometric Polymerase Activity Assay란 무엇인가요? | 고마바이오텍

1. EvaEZ™ Fluorometric Polymerase Activity Assay란 무엇인가요?

DNA Polymerase의 활성을 확인하기 위한 방법입니다. kit는 Polymerase Activity를 확인하기 위한 형광 primed substrate(template)와 EvaGreen® dye, dNTPs, ROX reference dye mixture로 구성되며, DNA Polymerase의 활성이 있는 경우, primed template가 이중가닥을 생성하고 여기에 EvaGreen Dye가 반응하여 형광이 증가하게 됩니다.  

2. EvaEZ™ Assay를 하기 위해서는 어떤 기기를 사용해야 하나요?

Real-time qPCR instrument를 사용하는 것을 권장합니다. 플레이트와 튜브를 사용할 수 있다면, 플레이트를 사용하는 것이 멀티 피펫을 사용할 수 있어 변동을 줄이는 데 도움이 되며, 샘플을 빠르게 로딩할 수 있어 assay 온도를 제어하는 데에도 도움이 됩니다. 기기에 ROX normalization 옵션이 있다면 이 또한 변동을 줄이는 데 도움이 됩니다. 

그 외에는, fluorescent microplate reader를 사용하는 것을 권장합니다. Plate reader는 녹색 형광(예. FITC channel, Ex/Em: 485/530 nm)을 읽을 수 있어야 하며 사용하는 효소에 적합한 온도까지 가열할 수 있어야 합니다. Plate seal을 이용하여 증발을 방지하는 것을 권장합니다. 

3. 어떤 희석 버퍼를 선택해야 하나요?

50 % 글리세롤 등 stabilizing ingredient를 포함하는 버퍼를 이용해야 합니다. 연속 희석을 할 때는 enzyme stock solution과 동일한 storage buffer를 이용하여, 글리세롤 및 다른 버퍼 구성요소의 농도가 동일하도록 합니다.  

4. Assay linearity를 최적화하기 위해서는 온도를 어떻게 설정해야 하나요?

EvaEZ™ Assay의 선형 범위를 최대화하기 위한 최적의 온도는 실험하는 효소에 대해 보고된 최적의 온도와 다를 수 있습니다. 상대적으로 낮은 온도를 사용하면 시그널의 plateau가 지연되고 더 넓은 선형 범위를 얻을 수 있습니다. 아래 그림은 동일한 Taq polymerase 샘플에 대해 다른 Assay 온도를 비교한 것입니다. Taq이 70-75°C에서 가장 촉매 활성이 높은 것으로 보고 되었지만, EvaEZ™ Assay는 54°C에서 가장 넓은 선형 범위를 나타냈습니다. 

5. Enzyme을 섞을 때 vortexing을 해도 되나요? 

아니요. 효소 용액을 섞을 때 파이펫팅을 하여 잘 섞이도록 하고, vortex는 하지 않습니다. 짧게 원심분리를 하여 튜브 하단의 용액을 수집합니다. 

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