1. Biosilk란 무엇인가요?
Biosilk fiber는 3D 배양을 위한 recombinant matrix로, spidroin (스피드로인)이라고 하는 거미줄 단백질 성분에, ECM에 대한 세포 부착을 담당하는 RGD(Arginylglycylaspartic acid) peptide motif sequence를 접목한 재조합 실크 단백질입니다. Biosilk에 recombinant Biolaminin 521이 혼합된 Biosilk 521은pluripotent stem cell의 증가와 분화를 위한 3차원 환경을 조성합니다.
2. Biosilk 521에 혼합된 Biolaminin 521의 양은 얼마나 되나요?
9ug/ml입니다. Biosilk 521 용액은 silk 10 : biolaminin 521 1, 즉 10:1의 비율로 혼합되어 있습니다.
3. Biolaminin 521외에 다른 Biolaminin을 Biosilk에 혼합할 수 있나요?
네, 가능합니다. Biosilk solution 250ul에 Biolaminin을 25ul 혼합하고 bubble이 생기지 않게 파이펫팅으로 잘 섞어줍니다. Final mixture는 9ug/ml Biolaminin 농도가 됩니다.
4. Biolaminin 521과 Biosilk 521은 세포에 어떤 효과를 주나요?
Biolaminin 521 (laminin-521 protein)은 배아세포의 inner cell mass에서 human PSC에 의해 발현되고 분비되는 천연 줄기세포 niche의 핵심적인 cell adhesion protein입니다. 이는 in vitro에서 생물학적으로 동등한 hPSC 환경을 만들어 줍니다. PI3K/Akt signaling pathway를 유도하고, hESC와 iPSC의 높은 생존율과 장기간의 self-renewal을 촉진합니다. ROCKi를 사용하지 않아도 세포의 높은 생존율을 지원하고, Biosilk 환경에서는 세포구성을 촉진합니다. Biosilk와 Biolaminin 521이 혼합된 Biosilk 521은 hESC 및 iPSC의 증식과 분화를 위한 3D 배양 환경을 조성합니다.
5. Biosilk 환경에서 세포는 어떻게 분포되나요?
기존의 3D scaffold에서는 3D network이 이미 형성된 후에 세포를 심었지만, Biosilk는 silk network이 형성되기 전에 Biosilk 용액에 cell을 혼합합니다. 즉, 새로 형성된 silk fiber가 세포를 캡슐화하고 세포가 3D matrix 전체에 고르게 분포됩니다. Silk fiber가 형성되는 동안 생기는 air bubble의 결과로 porous하여 media의 영양분과 산소를 훨씬 더 많이 접촉할 수 있습니다.
6. Biosilk는 gel인가요?
아닙니다. 젤이라기 보다는 섬유질의 네트워크에 가깝습니다. Biosilk 제품은 거미줄 기반의 생체재료로, 다양한 ECM 단백질과 함께 기능화되고, 서로 다른 3차원 구조를 형성합니다.
7. Biosilk를 오가노이드 배양에 이용할 수 있나요?
네. Biosilk는 오가노이드 배양을 위한 탁월한 3D 배양 시스템입니다.
PSC를 cell culture well 바닥에 부착된 Biosilk-Biolaminin 거품에 넣고 원하는 confluency까지 증폭시킵니다.microfibrillar network안에서 원하는 confluency에 도달하면 cell scraper나 pipette tip으로 well 바닥에서 거품을 떼어냅니다. 가위나 칼로 거품을 2-4조각으로 (두께는 약 2mm) 자르고 부유할 수 있도록 새로운 low-attachment culture plate로 옮깁니다.
8. Biosilk를 hydrogel에 혼합해도 되나요?
거품을 형성한 후에는 Biosilk에 hydrogel을 추가해도 됩니다. 그러나 organoid를 Matrigel에 넣을 필요는 없습니다.
9. Biosilk를 이용하면 Hydrogel에서 세포를 배양하는 것과 어떤 차이가 있나요?
세포의 확산과 증가에 있어 큰 차이가 있습니다. Biosilk는 좀더 실제 조직과 비슷한 환경을 구축하여 focal adhesion point를 촉진시킵니다. Biosilk내에서 세포는 더 긴 모양을 형성하고, silk 구조속에서 명확한 방향 정렬을 가지며 점점 더 퍼져 나갑니다. 반대로 Hydrogel에서 캡슐화된 세포는 구형의 형태를 가지며 퍼지는 현상이 없습니다.
10. Silk 분자가 분해되기까지는 얼마나 걸리나요?
1개월-6개월 정도 소요됩니다.
11. Biosilk는 동물성분이 포함되어 있나요?
아니오, Biosilk는 화학적으로 조성이 확인되었고, 동물성분도 포함되어 있지 않습니다.
12. Biosilk의 점성과 녹는점, 분자량은 어떻게 되나요?
용액상태에서의 점성은 PBS buffer와 비슷합니다. (only 0.3wt% protein)
Biosilk가 3D network에서 거품을 형성할 경우에는 점성을 측정할 수 없습니다. Biosilk는 gelation temperature는 없고 47도에서 unfold되기 시작합니다. 분자량은 25kDa 입니다.
13. Biosilk에 있는 세포로 immunocytochemistry를 수행할 수 있나요?
네, 가능합니다. silk/cell construct를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 embedding후 section을 진행합니다. silk가 건조되지 않게 주의해야 합니다.
14. Biosilk 거품에서 cell을 깨끗하게 분리할 수 있나요?
네, 가능합니다. trypsin이나 Accutase 같은 enzyme 방법을 이용하여 silk 거품으로부터 cell을 분리할 수 있습니다.
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