1. 가장 중요한 매개변수는 무엇인가요?
두 대조군이 가장 중요합니다. 첫번째로 약물을 넣지 않은 음성 대조군이 필요합니다. 독극물이 없는 상태에서 DNA peak fraction에서 topo level은 낮으며, 내인성 효소는 모두 유리 상태의 topo로 방출됩니다. 두번째로 양성 대조군이 필요합니다. 예를 들어, VP16이나 camptothecin과 같은 IFP(interfacial poison)에 대해 적절한 항체와 매칭된 것이 양성 대조군이며, 특정 세포 또는 시스템에서 내재 효소의 크로스링크를 감지하기 위해 필요합니다.
2. ICE-Δ는 무엇이며, 왜 중요한가요?
음성 대조군은 western slot에서 백그라운드 노이즈를 나타냅니다. 독극물이 없는 상태에서도 일부 신호가 나타납니다. 목표 대조군 약물과 특정 AB probe를 매칭할 때 명확한 증가가 보입니다. 이를 ICE delta 또는 ICE-Δ라고 합니다.
ICE-Δ가 낮으면 (2 미만), AB probe를 적정하여 최적화해야 합니다. 약한 독극물을 사용한다면 세포에 약물을 노출하는 시간을 늘이거나 약물의 input을 증가합니다.
3. Slot이나 Dot blot을 할 때 DNA의 양을 증가시키며 배치해야 하는 이유는 무엇인가요?
Slot이나 Dot blot을 할 때 신호가 강하면 신호는 쉽게 포화됩니다. 이러한 이유로 최소 세 종류의 DNA input을 시도하여 최적의 ICE-Δ를 만드는 농도를 찾아야 합니다.
4. ICE Assay는 독극물을 식별하는 용도로만 사용할 수 있나요? 아니면 catalytic inhibitor를 추적하는 용도로 사용할 수 있나요?
Anti-topo drug 기작은 두 종류가 있습니다. 첫번째는 공유 복합체를 trap하는 Interficial Poisons(IFPs)이고, 다른 하나는 단순히 topo의 작용을 억제하는 Catalytic inhibitory compounds(CICs)입니다. CIC를 테스트하기 위해서는 IFP 유형의 약물을 사용할 수 있습니다. 예를 들면, Topo II를 테스트하기 위해 VP16을 사용하는 것입니다. 이러한 경우, 우선 추정되는 CIC를 전처리하고, 약물 유무와 약물들의 처리 간격을 조절하며 IFP pulse (30'-60')가 얼마나 효율적으로 억제되는지 비교할 수 있습니다. 진정한 CIC가 IFP의 트래핑 능력을 억제한다는 점에 착안한 것입니다. 상세한 내용은 달라질 수 있지만 이 접근 방식은 대부분의 CIC에서 적용될 수 있고 적용될 것입니다.
5. Topo III kit에 topo I drug과 topo I AB를 포함한 이유가 있나요?
현재로는 topo III IFP로 알려진 화학물이 없기 때문입니다. ICE 분석이 기대하는 결과를 낼 수 있다고 확신하기 위해서는 동일한 시스템에 다른 IFP와 효소를 테스트 하는 것이 중요합니다.
6. 판매중인 Topo reference DNA는 무엇이 있으며, 왜 중요한가요?
미리 테스트한 Topo/GENOMIC DNA 복합체를 ICE Blot의 내부 대조군으로 포함하여 고객님의 블로팅 테크닉을 검증할 수 있게 하였습니다. Top2A와 VP16과 같이 약물과 항체를 매칭한 top/DNA 복합체를 준비하고 pre=screen했습니다. 그리고 알려진 negative gDNA도 제공합니다. 꼭 필요하지는 않지만, 처음으로 이 방법을 사용할 때는 이런 control complex가 도움이 될 것입니다. 레퍼런스 DNA 복합체는 topo I과 topo IIa 복합체에 대해서만 제공됩니다. (Order: TG1020-1REF for Top1 and TG1020-2a for Top2a control complexes.)
7. ChIP-Seq Analysis에서 이 complex를 사용할 수 있나요?
네, 가능합니다. 단, 포름알데히드 크로스링크 과정은 하시면 안 됩니다.
이 약물들은 모두 IFP이기 때문에 다른 크로스링크 작용제가 필요하지 않습니다. 이런 분석을 위해서는 음성 대조군(no drug), Camptothecin, etoposide와 같은 중요한 대조군들이 있습니다.
8. No drug control에서 백그라운드가 높게 나오는 이유는 무엇인가요?
여러 이유가 있겠지만 가장 큰 이유는 DNA 준비 과정입니다. RNA나 단백질 오염이 없이 gDNA만 준비되도록 해야 합니다.
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