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[FAQ] Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 사용법 이미지

[FAQ] Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 사용법

Maker : R&D SYSTEMS

Cell Counting Kit-8 사용법과 실험팁 및 주의사항을 안내합니다.

실험 과정


Step A. 세포 수 측정 

 

  1. 96well 플레이트에 세포 현탁액을 100 µL씩 분주합니다.
  2. 각 well에 CCK‑8 용액을 10 µL씩 첨가합니다. (거품이 생기지 않도록 well 가장자리에 넣는 것이 좋습니다.)
  3. 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 1~4시간 동안 배양합니다.
  4. 마이크로플레이트 리더를 사용해 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.
  5. 측정이 지연될 경우, 각 well에 1% SDS 또는 0.1 M HCl을 10 µL 첨가하면 흡광도 값이 안정화되어 실온에서 최대 24시간까지 측정이 가능합니다.

 

 

Step B. 세포 증식 및 세포독성 평가

 

  1. 96well plate에 세포를 5,000 cells/well 농도로 100 µL씩 분주합니다.
  2. 세포를 24시간 전배양한 후, 실험물질을 다양한 농도로 10 µL씩 첨가합니다.
  3. 6~48시간 동안 배양합니다.
  4. 이후 각 well에 CCK‑8 용액 10 µL를 넣고 1~4시간 배양합니다.
  5. 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.


실험 팁 및 주의사항

1. 세포 수 설정

  • 세포 종류에 따라 필요한 최소 세포 수가 다릅니다.
  • 부착 세포의 경우, 최소 1,000 cells/well 이상이 필요합니다.
  • 부유성 세포(예: 백혈구)는 최소 2,500 cells/well 이상을 권장합니다.
  • 96well plate에서는 최대 약 25,000 cells/well까지 측정이 가능합니다.
  • 24well이나 6well plate를 사용할 경우에는 부피에 맞게 세포 수와 시약량을 비례적으로 조절해야 합니다.

2. 백그라운드 값 보정

  • 정확한 OD(흡광도) 값을 얻기 위해서는 blank 보정이 필요합니다.
  • 세포가 없는 well (배지만 있는 well)의 흡광도 값을 측정하여, 각 샘플 값에서 이를 빼주는 방식으로 보정합니다.

3. 흡광도 측정 조건

  • 가장 적절한 파장은 450 nm입니다.
  • 430~490 nm 범위 내의 필터도 대체로 사용할 수 있으나, 가능한 경우 450 nm 필터 사용을 권장합니다.

4. 시약 처리 시 주의사항

  • CCK‑8 용액을 well에 넣을 때 거품이 생기지 않도록 조심해야 합니다. 거품이 생기면 흡광도 측정에 영향을 줄 수 있습니다.
  • 시약을 well의 벽면을 따라 천천히 떨어뜨리는 방식이 권장됩니다.

5. 측정 지연 시 대처 방법

  • 실험 후 OD 측정을 바로 하지 못할 경우, 각 well에 1% SDS 또는 0.1 M HCl을 10 µL씩 첨가하면 formazan 생성물이 안정화되어 실온에서 최대 24시간까지 보관 후 측정이 가능합니다.

6. 배지 및 형광 간섭

  • formazan은 수용성이므로 별도 용해 과정이 필요하지 않습니다.
  • 페놀레드가 포함된 배지를 사용할 경우, OD 값에 영향을 줄 수 있으나, blank 보정으로 보완 가능합니다.
  • 형광 실험과 병행할 경우에도 CCK‑8 시약은 대부분의 형광 신호에 간섭하지 않아, 동일 샘플로 다중 분석이 가능합니다.


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