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[FAQ] Viability PCR과 PMA

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　 1. EMA, PMA, PMAxx의 차이점은 무엇입니까?
　 Viability PCR은 원래 EMA (ethidium monoazide)를 이용하여 dead cell DNA를 불활성화시켰습니다. Biotium은 Montana State University와 협력하여 PMA (propidium monoazide)를 개발했습니다. PMA는 EMA에 비해 dead cell에 대해 더 선택적이며 viable microbe와 virus 검출에 널리 사용되어져 왔습니다. PMAxx는 Biotium에서 출시된 새로운 viability PCR dye로, dead cell DNA가 PCR 증폭이 되지 않도록 하는데 더 효과적입니다. 그래서 live & dead bacteria를 가장 잘 구별할 수 있습니다.
　 2. PMA stock은 DMSO에 준비해야 하나요?
　 비수용성인 EMA와는 달리 PMA나 PMAxx는 수용성이라 20mM solution in water로 제공됩니다. 고체로 제공될 경우에도 DMSO에 녹일 필요는 없습니다. 
　 3. PMA나 PMAxx의 phytolysis를 위해 어떤 광원을 이용해야 하나요?
　 Biotium은 PMA-Lite LED Photolysis Device를 제공합니다. 광원을 통해 PMAxx나 PMA를 dsDNA로 cross-linking 시킵니다. 
　 4. PMA를 사용하고 있는데 PMAxx로 바꾸어야 하나요?
　 Bacteria를 이용하여 viability PCR 결과를 비교해 보았을때 PMAxx가 더 활성이 좋았습니다. 최근 노로바이러스를 이용한 viability PCR 논문에서도 PMAxx가 더 잘 작용했음을 확인할 수 있습니다. Yeast의 경우에는 PMA가 PMAxx와 비슷하거나 조금 더 활성이 좋았습니다. 따라서 baceria나 virus에는 PMAxx, yeast나 fungus의 viability PCR에는 PMA를 추천합니다.
　 5. PMA나 PMAxx를 환경 샘플에 사용할 수 있나요?
　 네, 많은 연구자들이 이미 환경 샘플에 사용하고 있으나 pure culture 보다는 고려할 사항들이 있습니다. 환경샘플에 이용한 논문을 참고해 주세요.
Water samples In order to perform viability PCR on water samples, some users have developed methods to concentrate the microorganisms onto a 0.45 um filter, and then treat the filter with PMA. An example protocol can be found in this publication: Ditommasso S., et al. (2015) Viability-qPCR for detecting Legionella: Comparison of two assays based on different amplicon lengths. Mol. Cell Probes. doi: 10.1016/j.mcp.2015.05.011.

Opaque or complex samples Viability PCR with PMA has been successfully reported in various complex sample types, such as sewage or soil. No reports have been made yet with PMAxx™ in complex samples, but we would expect it to work as well or better than PMA. The main considerations for complex samples are dye concentration and light penetration. Typically a higher dye concentration (100 uM or more) is needed because some dye may bind to contaminants in the sample. Longer light treatment and more mixing during light treatment may be required, since it will be harder for the light to penetrate through the sample. An example protocol can be found in this publication: Guo F. and Zhang T. (2014) Detecting the nonviable and heat-tolerant bacteria in activated sludge by minimizing DNA from dead cells. Microb. Ecol. dio 10.1007/s00248-014-0389-2.
　 6. PMA나 PMAxx를 실수로 실온에 방치했을때 안정성이 괜찮을까요?
　 빛에 노출되지 않는다면 chemically stable 하므로 괜찮습니다. 열흘간 실온에서 방치한 후 HPLC로 분석했을때 문제가 없음을 내부실험을 통해 확인하였습니다. 빛에 매우 민감하여 room light 에도 영향을 받을 수 있으며 chemical change를 초래합니다. 따라서 항상 어두운 곳에서 핸들링 하시기를 조언드립니다.
　 7. PMA-Lite에서 LED 조명의 파장과 밝기는 어느정도 입니까?
　 PMA-Lite의 LED는 600-800 밀리 칸델라 (mcd)의 밝기를 갖습니다. 각 튜브 옆에 3 개의 LED가 있고 (한 쪽 하단, 두 쪽) 파장은 465-475nm입니다.
　 8. PMA 또는 PMAxx 처리 후 DNA를 정제해야 하나요? 아니면 시료에서 직접 PCR을 수행 할 수 있습니까?
　 일반적으로는 PMA 처리 후에 세포에서 DNA를 정제하여 PCR template로 사용하는 것으로 알려져 있습니다. 그렇지만 DNA 정제없이, PMA를 처리한 cell lysate로도 viability PCR이 잘 수행된 사례들이 많이 있습니다. 가장 중요한 것은 lysate 준비하기 전에 모든 PMA dye들이 제대로 photolysis가 되었는지를 확인하는 것입니다. 분해되지 않고 잔존하는 PMA가 PCR 과정에 방해를 줄 수 있습니다. 만약 이 방법을 원하신다면, dye 및 light 처리를 한 이후에 용액에 남은 dye를 제거하기 위해 cell을 pellet화 하는것이 좋습니다. 이상적인 PMA 및 light 처리 조건을 결정하기 위해 control 실험을 같이 수행하셔야 합니다.
　 9. PMA나 PMAxx 처리 전 후에 sample을 얼려도 되나요?
　 이 dye들은 membrane-impermeable dye이며, membrane이 손상된 dead cell에 작용하여 DNA를 변형시키는 원리를 이용합니다.
만일 샘플이 PMA 처리전에 얼려져 있다면 live cell membarne도 투과하여 live/dead cell 구분을 하지 못하게 됩니다. PMA 처리하여 photolysis까지 진행된 후에는 DNA extraction과 PCR 전에 보관을 위해 얼려도 됩니다. 
　 10. viability PCR을 위해 어떤 primer를 이용해야 하나요?
　 Biotium에서는 일부 균주용에 대한 viability PCR kit를 제공합니다. 여기에는 strain-specific primer set가 제공됩니다. amplicon length가 viability PCR에 영향을 많이 미칩니다. 긴 길이의 amplicon일수록 더 좋은 결과를 제공하므로 길게 디자인하세요.
　 11. 그람양성과 그람음성 박테리아가 혼합된 unknown sample을 처리할 때, PMA Enhancer를 사용해도 되나요?
　 아니요, PMA Enhancer는 그람음성 박테리아에만 사용해야 합니다. 그람양성 세균에는 유해한 영향을 끼칩니다. 
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