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 제품안내  형광시약   Protein Labeling  CF™ Dyes

[FAQ] Mix-n-Stain CF dye Antibody Labeling Kit

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  1. CF란 어떤 dye며, Alexa Fluor dye와 차이점은 뭔가요?
  CF dye는 Biotium사에서 개발한 단백질과 핵산을 labeling하는 매우 수용성의 small organic dye입니다. 20 컬러 이상의 CF dye는 Alexa Fluor dye보다 더 밝고 빛에 안정하여 오랫동안 지속됩니다.
  2. Mix-n-Stain™ Antibody Labeling Kit 종류가 많은데 어떻게 선택해야 하나요?
  아래의 킷트 호환성 및 프로토콜 flow chart를 참고하세요.
https://biotium.com/wp-content/uploads/2017/12/Mix-n-Stain-Compatibility-Protocol-Selection-Guide-1.jpg
  3. Mix-n-Stain의 최적의 라벨링을 위한 dye/protein의 비율은 어떻게 조정해야 하나요?
  킷트내에 dye가 이미 최적화 되어 있어서 dye의 양이나 반응시간을 조정할 필요가 없습니다.
  4. 항체 농도는 어떻게 맞추나요?
  킷트는 0.5-1.0mg/ml의 농도로 항체를 라벨링할 수 있도록 최적화되어 있습니다. 항체가 너무 희석되어 있으면 킷트내에 있는 ultra-filtration vial을 사용하여 원심분리로 농축할 수 있습니다. 항체가 너무 농축되어 있으면 1x PBS로 희석하여 사용합니다. 
  5. dye가 항체의 lysine이나 cysteine기에 부착이 되는건가요?
  dye는 antigen-binding site로부터 멀리 떨어진 아미노기에 공유결합으로 부착되어 항체의 affinity에 영향을 주지 않습니다. (정확한 부착 위치와 기전은 독점 정보라서 공개가 어렵습니다.)
  6. 라벨링 후 항체에 몇개의 dye molecule이 부착되나요?
  항체당 약 4-6 dye molecule이 부착되는 것으로 추정됩니다. 
  7. 정제 단계가 없는데, unconjugated dye는 어떻게 제거되나요?
  발명의 핵심 사항이라 정확한 기전 공개는 어렵습니다. 다만 모든 킷 구성품들이 고유의 formulation으로 제작되어 전통적인 방법의 라벨링이 갖는 그런 문제들을 완전히 제거하였습니다. live cell에 사용하기 위해서는 킷에 제공된 ultrafiltration vial을 이용하여 짧게 정제를 하거나, free dye의 endocytosis를 막기위해 4도에서 염색을 진행해야 합니다. 
  8. recovery yield는 얼마나 되나요?
  100% 입니다.
  9. 전체과정을 진행하는데 걸리는 시간은 얼마나 되나요?
  항체-dye-reaction buffer를 넣고 혼합하는 시간 30초, reaction 30분이면 됩니다. dye가 labeling된 항체는 바로 flow cytometry, microscopy, western blot등 형광 항체가 필요한 모든 실험에 사용할 수 있습니다. 
  10. reaction 시간을 30분 이상 두거나 30분 미만에 끝냈을 때 어떤 문제가 있을까요?
  라벨링 반응은 30분 후에 완료됩니다. 만약 반응 시간이 더 길더라도 라벨링에 악영향을 미치지 않습니다. 만약 30분 미만이었을 때는 킷에 같이 제공된 storage buffer에 섞은 후 이용해야 합니다.
  11. labeled antibody는 얼마나 안정한가요?
  킷이 제공하는 storage buffer에 넣어 4도에 보관했을때 적어도 6개월 이상은 stable합니다. 더 오랫동안 보관하고자 하신다면 분주하여 -20도에 보관하세요. 
  12. multi-color 면역형광염색을 할때 dye가 항체들간에 확산되거나 전이될 우려는 없나요?
  Mix-n-Stain 라벨링은 dye와 항체의 공유결합을 유발하므로 염료 확산 또는 전이가 없습니다.
  13. Mix-n-Stain으로 라벨링된 항체를 사용하는 것과, 형광 2차 항체를 사용한 것의 민감도 차이는 어떻습니까?
  Direct 염색은 indirect에 비해 덜 민감할 수 있습니다. 항체를 고농도로 사용하거나 gain setting을 더 높게 설정해야 할 수도 있습니다. 
  14. 그렇다면 2차항체를 사용하지 않고 direct 방법을 이용하는 이점은 무엇인가요?
  Direct 염색은 2차항체의 반응시간과 wash step을 줄이고 동종에서 multiple primary antibody를 이용하여 교차반응 없이 multi-color detection이 가능하게 합니다. (예, mouse-on-mouse staining) 
  15. Invitrogen사의 Zenon® antibody labeling kit에 비해 어떤 장점이 있나요?
  1. CF dye는 항체에 공유결합하여 부착하므로서 dye transfer나 multi-color staining시 항체간의 확산 염려가 없습니다.
2. Zenon labeling reagent가 30분 안에 사용해야 하는 반면 Mix-n-Stain 화합물은 4도 이하의 온도에서 storage buffer안에서 최소 3달간 안정합니다.
3. Zenon 제품이 항체의 fragment나 다른 linker를 이용하여 결합하는 것과 달리 Mix-n-Stain은 dye가 항체에 direct로 연결되기 때문에 화합물의 크기가 작습니다.
4. dye/protein 비율에 대한 최적화과정이 필요없이 섞어주신 후, 염색하기만 하면 됩니다.
  16. Mix-n-Stain kit로 항체와 다른 protein을 라벨링하는데 사용할 수 있나요?
  Mix-n-Stain kit는 IgG항체를 레이블링하는 데 최적화되어 있습니다. 그러나 다른 단백질을 라벨링할 수도 있습니다.
  17. 라벨링 반응은 BSA나 젤라틴이 있어도 괜찮은가요?
  BSA나 젤라틴이 들어있지 않은 antibody stabilizer의 경우 최고의 레이블링 결과를 얻을 수 있지만, BSA나 젤라틴의 양이 항체 무게의 4배를 넘지 않는 양일 경우 지장은 없습니다.
만약 BSA나 젤라틴의 양이 이것을 초과할 경우 protein A purification과정이나 통상적으로 사용되는 antibody clean-up kit를 이용하여 제거해주시면 됩니다.
  18. Sodium azide, EDTA, sugars, glycerol, Tris, DTT, 2-mercaptoethanol과 amoni acids와 같은 small molecule stabilizer/buffer의 구성성분에도 라벨링 반응에 문제가 없나요?
  Sodium azide, EDTA, small sugar과 같은 경우에는 레이블링에 영향을 끼치지 않습니다. Tris나 glycerol의 경우 적은 레벨에는 영향을 끼치지 않지만 Tris나 glycerol이 높은 레벨이나 DTT, 2-mercaptoethanol과 amoni acid(ex. Glycine)이 있는 경우는 피해야 합니다.
이러한 small molecule stabilizer/buffer 구성분은 antibody clean-up kit로 쉽게 제거됩니다.
  19. 키트 구성품을 나누어 사용하거나 한번 더 사용 할 수 있나요?
  Mix-n-Stain 키트는 한번 레이블링 하도록 만들어졌으므로, 항체를 한번 이상 레이블 하거나 한번 더 사용 하는 것은 권해드리지 않습니다.
   
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